兔缺血后肢侧枝形成和内源性vegf蛋白表达的实验分析

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1、上晦第二医科大学98级硕士学位论文jI言的成功，这再一次树立了人们对基因治疗的信心。但是也应该意识到，我41']目前对于自身侧枝循环形成的诱导因素和病理机制了解仍十分有限，在诸多方面仍有一些不同的见解。因此任何对新生血管生成机制的进一步发现，都可以使我们对现有缺血性疾病的治疗观念带来更新。本实验研究通过建立兔一侧后肢缺血模型，在设定的各个时间组中观察造模动物缺血后的病理生理及组织化学改变，以此了解侧枝循环形成过程中的内在机制，并验证VEGF在缺血组织中促血管生成作用和表达的时间范围，为进一步的基因治疗提供理论依据。7卜海第二医科大学98级

2、硕士学位论文第一部份缺血模型的建立和观察下肢动脉狭窄和闭塞引起的动脉供血不足是下肢缺血性疾病的病理基础。本实验采用新西兰白兔作为实验动物，以截取一侧股浅动脉的方法造成后肢缺血模型，随机分成不同的时间组，在不同的观察期内，观察兔缺血后肢动脉血压的变化情况和侧枝循环的形成过程。材料和方法一、材料1．主要仪器数字减影血管造影机(V3000)高压推注泵3F导引钢丝及动脉导管多功能血管诊断仪(7000PVL)显微外科器具2．主要试剂60％泛影葡胺戊巴比妥钠肝素钠注射液二、方法PHILIPS公司NAMlC公司TRACKER公司IMEX公司上海手术器械

3、厂上海信谊药厂广州化学试剂厂上海生物制剂厂1．实验动物新西兰雄性白兔40只，由上海嘉定陈行实验动物饲养场提供(具有实验动物许可证)。上海第二医科大学98级硕

4、j学位论文第一部份1．动物分组40只实验兔体重在2．8kg～3．5kg之间，随机分为空白对照组(0)，和造模后1天、3天、7天、14天、28天、56天及90天组(n=5)。2．兔后肢缺血模型的建立兔后肢缺血造模都选取动物的右后肢，而左后肢作为自身对照。实验动物以2％戊巴比妥钠经耳缘静脉注射进行麻醉，首次缓慢推注2ml，然后根据术中需要间断推注维持麻醉。麻醉生效后，动物仰卧固定，右后肢

5、术野剃净皮毛并用碘伏消毒。取腹股沟中点至膝内侧纵形切口。切开皮肤后解剖股动脉全长，切断腹股沟韧带，在内侧腹壁上动脉平面切断股总动脉，然后循股浅动脉走向，逐一切断结扎其分支直至胭、隐动脉分叉远端切断结扎，将股浅动脉整段取下。空白对照组仅作右下肢皮肤切开和缝合。右左图1．1：图示阴影部份为截取的动脉3．观察指标9上海第二医科大学98级硕士学位论文第一部份3．1大体观察观察实验动物造模期间存活情况以及缺血因素对造模肢体产生的外观改变情况。3．2小腿动脉压比率检测造模后按照设定的检测时间用PVL多功能血流诊断仪测量胫后动脉收缩压，以此作为小腿动脉

6、压。检测方法{6】：多谱勒探头探及胫后动脉后，将2．5cm宽的压脉带绑在腓肠肌上端，压脉带快速充气至预测的收缩压上30mmHg，然后缓慢放气，速度不超过3mmHg／s，听到第一声脉搏音即为动脉收缩压，然后计算小腿动脉压比率：每只造模动物两下肢(造模侧VS正常侧)胫后动脉收缩压的比值。3．3选择性动脉造影⋯每个时间组中任取3只动物进行动脉造影。方法：静脉麻醉后．颈部剃毛碘伏消毒，取颈正中切口，沿肌间隙分开颈部肌群后解剖颈外动脉，结扎动脉远心端，近心端穿刺并插入导引钢丝。在透视屏下见导丝进入降主动脉后置入导管鞘，拔除导引钢丝，经导管鞘插入3F

7、动脉导管并定位于主动脉分叉上1cm，然后在导管内推注1％肝素5ml。高压泵推注60％泛影葡胺10ml，速度为每秒4ml，共2．5秒。3．4侧枝血管数目计算⋯经双侧股骨中点，各画一条垂直于股骨纵轴的垂线，选择注射造影剂4秒后所摄x片。计算通过这条垂线的血管数目。4．统计分析：数据采用Spss统计软件包ANOVA方差分析SNK检验。结果1．大体观察0上海第二医科大学98级硕士学位论文第一舟B份所有造模动物均存活，在各个观察时间段内都未见后肢缺血性坏死、溃疡，但在造模14天组及以后各组别动物中发现造模后肢有毛发脱落变稀、毛皮发亮、趾甲缺损或萎陷

8、等缺血现象。2．小腿动脉血压比率造模动物缺血小腿的动脉压比率在7天组及以前各组别中检测值最低，仅占自身对照侧小腿动脉压的22％～30％。以后组别中，造模侧小腿动脉压比率逐渐升高(图1．2)，在模型动物28天组及以后各组别中，小腿动脉血压基本平稳，为自身对照侧小腿动脉压的55％左右(表1．1)。表1．1小腿动脉压比率表序号对照组——广———了———了堕!望等≠主兰毛可——1_SNK检验：上标字母不同有显著差异(p<0．05)。对照组I无组3无组7N组14无组28天组56N．姐90禾组图1．2小腿动脉压比率折线图上海第二医科大学98级硕上学位

9、论文第一部份3．选择性动脉造影选择性动脉造影结果显示：1天组，造模侧后肢股总动脉完全阻断，股浅、股深动脉均不显影(图1．4)。3天组，已有少量细小而断续的侧枝出现。7天组，侧枝血管增多，部份侧