SNT2736-2010-核果树溃疡病菌检疫鉴定方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!"!#!"#$"!%&%核果树溃疡病菌检疫鉴定方法$%&'&()*(+&(,*,+()*-*.&)*/(/-!"#$%&'&()""*+,(-)#01!'&+".+$(&+$'!2/'3&4,"5/%(6+)&4!%&%7&&7%&发布!%&&7%'7%&实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局!"!#!"#$"!%&%版权所有·禁止翻制、电子发售前!!言!!本标准按照!"!#$%$"&''(给出的规则起草#本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口#本标准起草单位$中华人民共和国山东出入境检验检疫局#本标准主要起草

2、人$吴兴海%厉艳%高文娜%邵秀玲%王英超%封立平%纪瑛#!!"!#!"#$"!%&%版权所有·禁止翻制、电子发售核果树溃疡病菌检疫鉴定方法&!范围本标准规定了进出境植物检疫中核果树溃疡病菌的检疫和鉴定方法#本标准适用于进出境植物及其产品中核果树溃疡病菌的检疫和鉴定#!!规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件&仅注日期的版本适用于本文件#凡是不注日期的引用文件&其最新版本'包括所有的修改单(适用于本文件#!"!#))*&!分析实验室用水规格和试验方法+,!#$$-.!进出境植物苗木检疫规程+,!#$*'(!进出境植物种子检疫规程#!原理#%&!分类学地位核果

3、树溃疡病菌)!"#$%&'&()""*+,(-)#/0%'&+".+$(&+$''1234567(829:;<=56*属原核生物界'>32?53@2=32=<2B5?=<3C5(%"D变形细菌纲'!5445/32=<2B5?=<3C5(%假单胞杆菌目'>A<97242:5756A<97242:575?<5<(%假单胞杆菌属'!"#$%&'&()"(##%!!鉴定依据核果树溃疡病菌的寄主范围%传播途径%形态特征%生物学特性%血清学特性%致病性反应以及分子生物学特征作为制定本检疫鉴定标准的依据#'!仪器超净台+生物培养箱+>EF仪+凝胶成像系统+电

4、泳仪+酶标仪+荧光显微镜#(!药品试剂与培养基实验用水$应符合!"!#))*&中一级水的规格+四氮唑=<=35G26C94?H623C7<'#IE(+/)0J,K聚合酶+L"+琼脂糖+J,KM53N<3+培养基#推荐采用M+O和M>O两种'或其中一种(半选择性培养基&细菌增殖的P"%,K培养基&具体配方参考附录K#$!"!#!"#$"!%&%版权所有·禁止翻制、电子发售$!现场检疫$%&!抽样方法棋盘式%五点式或随机抽样#$%!!抽样数量$%!%&!种子对来自核果树溃疡病发生国家和地区'参见附录"(的种子按+,!#$*'(进行抽样#$%!%!!整株植物或插枝对种苗按+,!#$$-.进行抽样

5、#$%!%#!症状检查参见附录"的"%)症状特征检查植株&切取或将整棵植株取回实验室检验#"!实验室检验"%&!病菌分离"%&%&!从种子分离取种子$'''#&'''粒&根据种子的质量&用无菌蒸馏水按$Q&比例浸泡#于RS#-S下静置$)H#$*H或过夜#充分混匀后倒出浸出液#取$'%$''和$'''倍稀释液各$4T&分别倒入4>O和'或(M+O培养基平板&并用T形玻棒在平板上涂抹均匀&每个浓度分离-个#$'个平皿&&-S条件下培养&RH#.&H&观察所产生的菌落#"%&%!!从植物组织材料分离取可疑植物组织&.-U酒精消毒&无菌水洗O次后&放入无菌的培养皿中&用无菌的玻璃棒研碎&滴$滴#

6、-滴无菌水于研碎的病组织上#静置&4C:#-4C:后&用稀释法或无菌的移植环蘸取以上组织液在培养基平板上划线&&-S培养&RH#R*H后&观察菌落生长情况#"%!!细菌培养特征及纯化"%!%&!菌落培养特征菌落具有以下培养基上的特征'使用紫外灯观察菌落荧光(&可以确定为可疑菌株#"""在M>O培养基上$表现为奶油状凸起菌落&产生强的橙黄色荧光+"""在M+O培养基上$出现果聚糖凸起菌落&形成白色或灰白色椭圆状隆起&全缘&粘稠状+"""在P"培养基上$白色菌落&在培养$&7#$R7后有少量晶状体出现&产生微弱的蓝色荧光+"""含-U蔗糖,K培养基上$&7后细菌培养物呈现白色乳状#"%!%!!

7、纯化根据.%&%$中核果树溃疡病菌菌落的形态特征&挑取可疑的单个菌落&在P"培养基或含-U蔗糖,K培养基上经O次划线纯化后'在&*S下培养&RH#R*H(&对可疑分离物的菌落特征进行观察和描&!"!#!"#$"!%&%版权所有·禁止翻制、电子发售述记载&观察有无荧光色素产生&并进行革兰氏染色及鞭毛染色#"%#!致病性测定"%#%&!果实接种分离的可疑分离菌株在P"培养基或含-U蔗糖,K培养基上&-S培养R*H&挑取菌落配