SNT2462-2010-棉花曲叶病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４６２—２０１０棉花曲叶病毒检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮狅狋狋狅狀犾犲犪犳犮狌狉犾犅犲犵狅犿狅狏犻狉狌狊２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２４６２—２０１０前言本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、浙江大学、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：张祥林、周雪平、朱水芳、王翀、吴卫、余永杰。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ标准分享网www.bzf

2、xw.com免费下载犛犖／犜２４６２—２０１０棉花曲叶病毒检疫鉴定方法１范围本标准规定了棉花曲叶病毒（ＣｏｔｔｏｎｌｅａｆｃｕｒｌＢｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ，简称ＣＬＣｕＶ）的检疫鉴定方法。本标准适用于可能带有棉花曲叶病毒的活体寄主植物的检疫鉴定。２原理棉花曲叶病毒的分类地位属于双生病毒科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、菜豆金色花叶病毒属（Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）。该病毒的生物学特性、血清学特性和分子生物学特征是制定本标准的主要依据（参见附录Ａ）。３仪器设备和用具３．１仪器设备电子天平（感量１／１０００ｇ）、超净工作台、高速冷冻离心机、小型低速离心机、ｐＨ计、恒温水浴锅、微量

3、榨汁机、超低温冰箱、高压灭菌器、酶标仪、ＰＣＲ仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪等。３．２用具研钵、培养皿、可调式微量移液器（２μＬ、１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１０００μＬ）及相应的移液器头、９６孔酶联反应板、离心管（１．５ｍＬ、１０ｍＬ）、ＰＣＲ管（０．２ｍＬ）、量筒、烧杯、镊子。４试剂、缓冲液及溶液４．１１０×犘犅犛犜缓冲液氯化钾（ＫＣｌ）２ｇ、氯化钠（ＮａＣｌ）８０ｇ、磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）２ｇ、磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）１１．５ｇ、吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）５ｍＬ，用浓盐酸（ＨＣｌ）调节ｐＨ至７．４，加蒸馏水定容至１０００ｍＬ

4、，４℃条件下贮存。４．２样品提取缓冲液亚硫酸钠（Ｎａ２ＳＯ３）１．３ｇ、聚乙烯基吡咯烷酮（ＭＷ２４０００～４００００，ＰＶＰ）２０ｇ、叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ、吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）２０ｍＬ溶解于８００ｍＬ１×ＰＢＳＴ中，用盐酸调节ｐＨ至７．４，加１×ＰＢＳＴ定容至１０００ｍＬ，４℃条件下贮存。４．３包被缓冲液碳酸钠（Ｎａ２ＣＯ３）１．５９ｇ、碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）２．９３ｇ、叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ，用浓盐酸（ＨＣｌ）调节ｐＨ至９．６，加蒸馏水定容至１０００ｍＬ，４℃条件下贮存。４．４洗涤缓冲液将１×ＰＢＳＴ缓冲液用浓盐酸（ＨＣｌ）调节ｐＨ至７．４，４℃条件

5、下贮存。４．５酶标抗体缓冲液１×ＰＢＳＴ缓冲液８００ｍＬ、小牛血清白蛋白（ＢＳＡ）２ｇ、聚乙烯基吡咯烷酮２０ｇ、叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ，用无菌蒸馏水定容至１０００ｍＬ，４℃条件下贮存。４．６底物（犘犖犘犘）缓冲液二乙醇胺９７ｍＬ、叠氮钠（ＮａＮ３）０．２ｇ，用浓盐酸（ＨＣｌ）调节ｐＨ至９．８，用无菌蒸馏水定容至１０００ｍＬ，４℃条件下贮存。４．７底物（犘犖犘犘）溶液将４硝基酚磷酸钠盐（ＰＮＰＰ）１００ｍｇ溶解于ＰＮＰＰ底物缓冲液１００ｍＬ中，现配现用。１犛犖／犜２４６２—２０１０４．８终止反应液氢氧化钠（ＮａＯＨ）４０ｇ，用无菌蒸馏水定容至１０００ｍＬ。４．９提取缓

6、冲液犃葡萄糖６０ｇ、ＮａＤＩＥＣＡ２３ｇ、聚乙烯基吡咯烷酮２０ｇ、巯基乙醇０．８ｍＬ，溶解于１０００ｍＬ蒸馏水中，常温下贮存。４．１０提取缓冲液犅１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ盐酸、２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、０．５ｍｏｌ／Ｌ氯化钠、１．５％ＳＤＳ，ｐＨ８．０。４．１１１０×犘犆犚缓冲液１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ盐酸，１０ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾。４．１２犜犃犈电泳缓冲液４０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＡｃ，２ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＥＤＴＡ。４．１３其他试剂液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、琼脂糖（电泳用）、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ。也可采用棉花曲叶病毒检测试剂盒。５检疫鉴定方法５．１双抗体夹心法（

7、犇犃犛犈犔犐犛犃）５．１．１样品制备取同一批次表现症状的寄主植株叶片和无症状叶片进行混合取样，用微量榨汁机或研钵研磨样品，其中加入样品提取缓冲液，植株叶片质量与样品提取缓冲液为１∶５（ｇ／ｍＬ）。将榨出的汁液分别盛装于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ后吸取上清液待用。５．１．２操作步骤５．１．２．１根据检测需要设计９６孔酶联板点样孔。包括２个阳性对照孔、２个阴性对照孔、２个～４个空白对照孔和多个待检测样品孔，待检测样品孔各重复两次。５．１．２．２每孔加入２００μＬ的ＣＬＣｕＶ包被抗体溶液，用封口膜包好，