SNT2080-2008-栎树猝死病菌检疫鉴定方法.pdf

《SNT2080-2008-栎树猝死病菌检疫鉴定方法.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０８０—２００８栎树猝死病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪狉犪犿狅狉狌犿犠犲狉狉犲狊，犇犲犆狅犮犽牔犕犪狀犻狀’狋犞犲犾犱２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２０８０—２００８前言本标准附录Ａ、附录Ｂ、附录Ｃ和附录Ｄ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准起草人：吴品珊、严进、廖太林、巫燕。本标准系首次

2、发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０８０—２００８栎树猝死病菌检疫鉴定方法１范围本标准规定了植物检疫中栎树猝死病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于针对栎树猝死病菌寄主的苗木、原木、树皮、枝条、枝叶等植物部分及其土壤和介质，以及木材、木包装和木制品的入境检疫。２原理２．１分类地位英文名：ｐａｔｈｏｇｅｎｏｆｓｕｄｄｅｎｏａｋｄｅａｔｈ，ｐａｔｈｏｇｅｎｏｆｒａｍｏｒｕｍｌｅａｆｂｌｉｇｈｔ学名：犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪狉犪犿狅狉狌犿Ｗｅｒｒｅｓ，ＤｅＣｏｃｋ＆Ｍａｎｉｎ’ｔＶｅｌｄ栎树猝死病菌（犘犺狔狋狅狆犺

3、狋犺狅狉犪狉犪犿狅狉狌犿），也称多枝疫霉，属真菌界（Ｆｕｎｇｉ），卵菌门（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）卵菌纲（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ），腐霉目（Ｐｙｔｈｉａｌｅｓ），腐霉科（Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ），疫霉属（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪ｄｅＢａｒｙ）。犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪狉犪犿狅狉狌犿可侵染多种林木和花卉植物，造成栎树等树木猝死（ＳｕｄｄｅｎＯａｋＤｅａｔｈ，简称ＳＯＤ），以及杜鹃、荚!等花卉枝叶枯萎（ＴｗｉｇＢｌｉｇｈｔｏｆＲｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ）。病菌在世界上的分布和寄主植物参见附录Ａ和附录Ｂ。２．２鉴定原理根据栎树猝死

4、病菌在寄主上的为害症状、形态学特性、巢式ＰＣＲ特异性扩增片段作为鉴定依据。３仪器和用具３．１仪器３．１．１生物显微镜，体视显微镜。３．１．２光照生物培养箱。３．１．３高压灭菌器。３．１．４高速离心机。３．１．５ＰＣＲ扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪。３．２用具３．２．１塑料盒。３．２．２黑光灯（１８Ｗ，３２０ｎｍ～３８０ｎｍ）。３．２．３塑料研杵，移液器。４试剂和培养基４．１试剂４．１．１琼脂粉，Ｖ８液，胡萝卜，杜鹃叶片。４．１．２５０％匹马霉素，氨苄青霉素钠盐，利福平钠盐，五氯硝基苯，碳酸钙。４．１．３ＳＤＳ，Ｔｒ

5、ｉｓＨＣｌ，氯化镁，盐酸，ＥＤＴＡ，氢氧化钠，乙酸钠，氯化钾，Ｔｒｉｓ，ＣＴＡＢ，ＴＢＥ，无水乙醇，苯酚，溴化乙锭（ＥＢ），三氯甲烷，异丙醇，异戊醇。４．１．４蛋白酶Ｋ，犜犪狇聚合酶，ｄＮＴＰ，ＤＮＡ分子量Ｍａｒｋｅｒ（１００ｂｐ）。４．１．５巢式ＰＣＲ引物Ｐｈｙｔｏ１／Ｐｈｙｔｏ４、Ｐｈｙｔｏ２／Ｐｈｙｔｏ３。１犛犖／犜２０８０—２００８４．２培养基４．２．１选择性培养基犘犃犚犘犞８５０ｍＬ过滤后的Ｖ８液，１７ｇ琼脂，９５０ｍＬ蒸馏水，灭菌后冷却到５０℃，加入在５０％的匹马霉素０．０１ｇ、氨苄青霉素钠盐０

6、．２５ｇ、利福平钠盐０．０１ｇ和五氯硝基苯０．０５ｇ（可按比例在二甲基亚砜中溶解后加入）。４．２．２胡萝卜丝培养基犆犘犃５０ｇ胡萝卜切丝，２２ｇ琼脂，１０００ｍＬ蒸馏水，灭菌。４．２．３犞８培养基Ｖ８液体１００ｍＬ，加入２．５ｇ碳酸钙，１５ｇ琼脂，蒸馏水９００ｍＬ，灭菌。５鉴定方法５．１症状检查检验苗木时，主要查验枝梢和叶部。杜鹃花等花卉植物症状为叶片上有黑褐色病斑，茎部有凹陷溃疡斑，枝梢和叶常出现枯萎。检验栎树等原木木材时，重点查验溃疡斑。溃疡凹陷或平坦，常有暗红至黑色的粘性流胶渗出，树皮内部组织褪色，坏死区

7、域的边缘有黑环围绕。取有疑似症状的植物的叶、枝、树皮、根等植物部分做分离培养。土壤和栽培介质也是传播病菌的主要途径，检验时收集被携带进境的土壤和栽培介质，做诱集试验。５．２分离培养和诱集５．２．１植物组织和木材的分离培养取植物组织或木材上的病健交界处（无明显症状的取靠近地下部的组织）５ｍｍ～１０ｍｍ，０．５％次氯酸钠消毒２ｍｉｎ～５ｍｉｎ，在选择性培养基ＰＡＲＰＶ８和胡萝卜丝培养基ＣＰＡ上，２０℃～２２℃黑暗培养１周～２周。如有白色真菌菌落出现，可转入Ｖ８培养基上２０℃１２ｈ光照／１２ｈ黑暗培养。５．２．２土

8、壤和栽培介质的诱集塑料盒中放入土壤或介质，加入２倍体积的无菌双蒸水，将数张健康的杜鹃叶片（国内市场上杜鹃品种即可）流水冲洗干净，滤纸吸干水分，叶面朝上漂放在水上，盖上盒盖，１５℃１２ｈ光照／１２ｈ黑暗培养。３ｄ后开始检查，取有失绿或水浸状斑的叶片，切取病健交界处，在胡萝卜丝培养基２０℃～２２℃黑暗培养１周～２周。５．３分子生物学鉴定５．３．１犇犖犃提取将有疑似症状的植物叶片、枝条、茎，