SNT2055-2008-豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０５５—２００８豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮狅狑狆犲犪狊犲狏犲狉犲犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２０５５—２００８前言本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李桂芬、李明福、魏梅生、张永江、相宁、王金花。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０５

2、５—２００８豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法１范围本标准规定了豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法。本标准适用于可能带有豇豆重花叶病毒的进境种苗或繁殖材料的检疫和鉴定。２原理豇豆重花叶病毒学名：ｃｏｗｐｅａｓｅｖｅｒｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，缩写：ＣＰＳＭＶ。豇豆重花叶病毒的生物学、血清学特性是本标准制定的主要依据；该病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、地理分布、传播途径、粒体形态等参见附录Ａ。３仪器和用具３．１仪器３．１．１酶标检测仪。３．１．２天平（０．００１ｇ）。３．１．３水浴锅。３．１．４隔离温室。３．２用具３．２．１可调移液器、可调移液器吸头。３．２．２酶联

3、板。３．２．３Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管。３．２．４研钵。４检疫鉴定方法４．１豆类种子检测前的处理应将种子播种在经高温消毒过的土壤中，置隔离温室中培养并观察生长情况，待长有６片～８片真叶时进行检测。首先选择可疑病毒症状植株进行检测，同时也要随机抽取植株样品进行检测。４．２双抗体夹心酶联免疫吸附测定法４．２．１试材４．２．１．１酶联板使用质量有保障厂商生产的酶联板。４．２．１．２包被抗体特异性好的抗豇豆重花叶病毒抗体。４．２．１．３酶标抗体碱性磷酸酶标记的抗豇豆重花叶病毒抗体。４．２．１．４包被缓冲液（狆犎９．６）碳酸钠（Ｎａ２ＣＯ３）１．５９ｇ碳酸氢钠（Ｎａ

4、ＨＣＯ３）２．９３ｇ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２０ｇ１犛犖／犜２０５５—２００８用蒸馏水定容至１Ｌ，４℃储存。４．２．１．５洗涤缓冲液（犘犅犛犜、狆犎７．４）氯化钠（ＮａＣｌ）８．０ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．２ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）１．１５ｇ氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）０．５ｍＬ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ用蒸馏水定容至１Ｌ。４．２．１．６样品抽提缓冲液亚硫酸钠（Ｎａ２ＳＯ３）１．３ｇ聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ，ＭＶ２４０００～４００００）２０ｇ用洗液（ＰＢＳＴ）定溶至１Ｌ，４℃储存。４．２．１．７酶标抗体稀释缓冲液

5、聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ，ＭＶ２４０００～４００００）２０ｇ牛血清白蛋白（ＢＳＡ）２ｇ用洗液（ＰＢＳＴ）定溶至１Ｌ，４℃储存。４．２．１．８底物缓冲液二乙醇胺（Ｃ４Ｈ１１ＮＯ２）９７ｍＬ蒸馏水（Ｈ２Ｏ）６００ｍＬ用盐酸（ＨＣｌ）调ｐＨ值至９．８，然后用蒸馏水定容至１Ｌ，４℃储存。４．２．２实验步骤４．２．２．１按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加１００μＬ。酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在３７℃孵育２ｈ。４．２．２．２清空酶联板孔中溶液，用ＰＢＳＴ加满各孔，３ｍｉｎ后倒掉孔中洗涤液，在吸水纸上拍干。再重复２次上述洗板过程。４．２．２．

6、３待检样品按１∶（２～１０）（质量浓度）加入样品抽提缓冲液，在研钵中研磨，低速离心，吸取上清液加入到酶联板孔中（１００／孔），每个待检样品设２个重复，设阳性对照孔、阴性对照孔、缓冲液对μＬ照孔。加盖或用保鲜膜包好，４℃冰箱孵育过夜。４．２．２．４清空孔中溶液，先在自来水下彻底冲洗３次；然后用ＰＢＳＴ加满各孔，３ｍｉｎ后倒掉，在吸水纸上拍干。再重复２次上述用ＰＢＳＴ的洗板过程。４．２．２．５按要求的浓度用酶标抗体稀释缓冲液稀释酶标抗体，每孔加入１００μＬ，加盖或用保鲜膜包好，３７℃孵育４ｈ。４．２．２．６清空孔中溶液，先在自来水下彻底冲洗３次；然后用ＰＢ

7、ＳＴ加满各孔，３ｍｉｎ后倒掉，在吸水纸上拍干。再重复２次上述用ＰＢＳＴ的洗板过程。４．２．２．７按１ｍｇ／ｍＬ的浓度将对硝基苯磷酸二钠盐溶于底物溶液中（使用前配制并注意避光以防变色）制成底物溶液。每孔加入１００底物溶液。加盖或用保鲜膜包好，室温避光孵育至颜色合适时μＬ读数。４．２．２．８酶标检测仪４０５ｎｍ波长下测定各孔的吸收值。４．２．３结果判定４．２．３．１对照孔的犗犇４０５值（缓冲液孔、阴性对照孔及阳性对照孔）应该在质量控制范围内，即：缓冲液２犛犖／犜２０５５—２００８孔和阴性对照孔的犗犇４０５值小于０．１５，当阴性对照孔的犗犇４０５值小于０．０

8、５时，按０．０５计算；阳性对照犗犇４０５值／阴性对照犗犇４０５值大于５；孔的重复性一致。４．２