SNT1454-2004-鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1454-2004鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法IsolationandidentificationforMarek'sdiseasevirusofchicken2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和国分众国家质量监督检验检疫总局‘’”SN/T1454-2004前言本标准的附录A、附录B均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国陕西出人境检验检疫局和山东出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人:陈

2、茂盛、管思平、马玉玲、寇改霞。本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T1454-2004鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法范围本标准规定了鸡马立克氏病病毒(MDV)的分离鉴定方法。本标准适用于鸡马立克氏病(MD)流行病学调查和口岸检疫.2材料准备2.1一日龄MD敏感鸡:用SPF种蛋孵化。2.2鸭胚成纤维细胞(DEF)的制备:见附录Ae2.3鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备:同2.2.2.4细胞培养液的制备;见附录B,2.5淋巴细胞分层液。2.6标准的MDV分型单克隆抗体。2.7缓冲溶液配制:磷酸盐缓冲

3、液(PBS);含0.05纬吐温-20的PBS,以上溶液配制方法见附录B,2.8标准MDV,MDV工型病毒GA毒株。3采样挑选临床发病的MD疑似病鸡，无菌采集构棣酸钠抗凝全血5mL/鸡~10mL/鸡，加人淋巴细胞分层液,200g离心5min，分离收集淋巴细胞，并用无菌PBS洗涤两次，用细胞维持液稀释成10，个/mL淋巴细胞的细胞悬浮液直接使用或者加人15%的二甲基亚矾后保存在液氮(-1960C)中备用。4操作方法41接种和培养取生长良好的DEF单层，弃去维持液，接种。.2mL处理好的淋巴细胞悬浮液，置含5%

4、二氧化碳的培养箱，37℃下吸附1.5h。补充适量维持液继续培养，24h内换液一次，以后每2d-3d换液一次。在培养过程中每日观察细胞病变(CPE)产生情况，同时设立不接种样品的空白细胞对照瓶。4.2收集在空白细胞对照瓶的细胞生长良好的前提下，将产生广泛CPE(蚀斑形成面积占30写以上)的DEF单层培养瓶中的维持液弃去，用。.0l%胰酶消化，加细胞生长液制成细胞悬浮液直接供鉴定用，或者加二甲基亚矾后置液氮(-1960C)中保存备用。4.3克隆将收集的具有广泛CPE的细胞悬浮液进行稀释，接种于96孔细胞培养板

5、，使每孔平均含有1个细胞，继续培养至孔内产生CPE。选择只有单个病灶的孔，吹打下孔壁细胞，移人细胞培养瓶扩大培养。同法重复克隆二至三次。所收集的培养物就是供鉴定用的MDV分离物。tSN/T1454-20045鉴定5.1电镜观察将MDV分离物按照常规方法制成超薄切片，磷乌酸负染，用电子显微镜观察病毒的形态和大小。5.2蚀斑测定用MDV分离物接种CEF次代单层，培养至72h，用测微器测量蚀斑大小，每份分离物至少测量10个蚀斑，取其平均值作为蚀斑大小的测定值。5.3单克隆抗体间接荧光染色试验将出现CPE的病毒分

6、离物接种到放置盖玻片的细胞管，置二氧化碳培养箱中培养观察。当出现明显的病毒蚀斑时，取出管内盖玻片，以冷的甲醇(-200C)在4℃条件下固定15min，然后用PBS冲洗三次(每次5min)，再滴加MDV分型单克隆抗体，放人37℃的水浴中作用90min-120min，用PBS冲洗三次(每次5min),滴加抗鼠免疫荧光抗体，在37℃水浴中作用30min，用含0.05%吐温-20的PBS冲洗三次(每次5min)，然后用荧光显微镜检查细胞内荧光出现情况。5.4容力鉴定用200。个蚀斑形成单位(PFU)的MDV分离物

7、和2000个PFU的GA标准强毒株分别接种一日龄易感鸡20只一25只，同时设立相同数日的易感鸡对照组。分别隔离饲养10周，观察记录死亡情况，并剖检死亡鸡。隔离饲养期满，实验鸡全部剖杀作肉眼病理检查.6结果判定6.1MDV在电子显微镜下表现为近似圆形或者六角形的病毒颗粒或者核衣壳，多数出现在感染的细胞核中，偶见于细胞浆中，大小为85qm---100nm,6.2MDV病毒可以在DEF或者CEF单层上产生蚀斑，蚀斑大小一般在1mm之内。血清I型产生的蚀斑较小，血清1型产生大合胞体的中等蚀斑，血清)I型产生大的蚀

8、斑。6.3经特异单克隆抗体间接荧光染色，在荧光显微镜下感染细胞将呈现清晰闪亮的黄绿色荧光。根据出现荧光的感染细胞所使用的单克隆抗体，可以确定MDV分离毒株为相应的血清型。6.4同时符合6.1,6.2,6.3三个试验结果的MDV分离物即可以判定为MDV，并确定其血清型。SN/T1454-2004附录A(规范性附录)鸭胚(鸡胚)成纤维细胞的制备A.1将SPF鸭种蛋孵化至12d-14d(SPF种鸡蛋孵化至9d-10d),A.2用碘配