SNT1165.1-2002-蓝舌病竞争酶联免疫吸附试验操作规程.pdf

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1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1165.1-2002蓝舌病竞争酶联免疫吸附试验操作规程ProtocolofcompetitiveELISAforbluetongue2002一11一25发布2003一05一01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T1165.1-2002月臼吕蓝舌病(BLuetongue)竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)是在参考国际兽疫局(OIE)(哺乳动物、禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》和实践经验的基础上制定。本标准的附录A是资料性附录。本标准由国家认证认可监督

2、管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人:花群义、周晓黎、徐自忠、董俊。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。SN/T1165.1-2002蓝舌病竞争酶联免疫吸附试验操作规程范围本标准规定了蓝舌病竞争酶联免疫吸附试验方法。本标准适用于反当动物蓝舌病抗体检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注

3、日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO3696:1987)缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1BTV:蓝舌病病毒3.2C-ELISA:竞争酶联免疫吸附试验。3.3McAb:单克隆抗体。3.4PI:抑制百分比。3.5羊抗鼠IgGHRP:辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠馆G.3.6OD值:光密度值。4原理被检血清和BTV群特异性单克隆抗体(McAb功A人已用BTV-VP7抗原包被的酶标板孔，在37'C下反应，二者同时竞争与孔内相应的特异性包被抗原结合，加人酶标羊

4、抗鼠工gGHRP，洗去未结合的抗体，然后加人底物显色。使用酶标仪测定反应物的OD值，计算抑制百分比(PD，就可以判定试验结果5试剂和材料5.1包被抗原:蓝舌病病毒VP7抗原，由指定单位提供。5.2血清:蓝舌病标准强阳性、弱阳性血清、阴性血清，由指定单位提供。5.3被检血清:牛血清56'C^-57℃灭活30min，羊血清58'C-59'C灭活30min5.4蓝舌病病毒群特异性单克隆抗体:由指定单位提供。5.5羊抗鼠IgG-HRP:按说明书指定的工作浓度稀释使用。包被液、洗涤液、稀释液、底物液、终止液:参见资料性附录A:.(水:符合G

5、B/T6682-1992分析实验室二级水规格。器械和设备6.1酶标仪。6.2可拆96孔酶标板SN/T1165.1-20026.3单孔道、多孔道可调微量移液器(1yL,50tL,100pL,l000IcL)、微量滴头。6.4吸管(5mL,10mL),6.5刻度量筒(100mL,l000mL),6.6试剂瓶(50mL,100mL,500mL),6.7洗涤瓶(500mL),6.8贮液器。6.9计算器。6.10370C恒温箱。7蓝舌病竞争酶联免疫吸附试验7.1包被酶标板:按照提供的包被抗原所附说明书要求，用包被液稀释抗原，包被96孔酶标板

6、，每孔50IiL，置4℃冰箱过夜。7.2按1:10稀释强阳性、弱阳性、阴性对照血清和所有被检血清。被检血清稀释可在试验前一天进行，置4℃过夜。7.3洗涤:取出酶标板，用洗涤液洗板三次，在纸巾上拍干。7.4加样7.4.1按表1所示设立稀释液空白对照、阴性血清对照、弱阳性血清对照、强阳性血清对照。7.4.2每份被检血清样品加两孔。7.4.3取100pL稀释液人空白对照孔，取50IL阴性、弱阳性、强阳性血清加人相应的对照孔，取50IL被检血清样品人相邻横行孔内，37'C湿盒感作1h,表1蓝舌病竞争酶联免疫吸附试验7.5McAb和羊抗鼠馆

7、GHRP的稀释McAb:按说明书要求，用稀释液稀释，混匀。羊抗鼠IgG-HRP:按说明书要求，用稀释液稀释，棍匀。7.6加McAb:每孔加50hl,McAb(空白对照不加)，轻轻混匀。酶标板置37'C湿盒感作30min。用洗涤液洗板五次，在纸巾上拍干7.7加酶结合物:除空白对照孔外，其他所有孔每孔加50川羊抗鼠烤GHRP。轻轻混匀。酶标板置370C湿盒中感作30min.7.8配制底物液:取出9.7ml底物液于棕色瓶中，加人TMB液300衅.和7砂30%双蒸水(Hz0z),充分混匀7.9洗涤酶标板五次。7.10加底物液:在室温下所有

8、板孔加100}