SNT1132-2002-松材线虫检疫鉴定方法.pdf

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1、松材线虫检疫鉴定方法MethodsforquarantineandidentificationofBursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)NickleSN／T1132—2002前言本标准的附录A、附录B为规范性附录，附录C、附录D均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：沈培垠、徐培方、周弘、刁彩华。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围本标准规范了松材线虫检疫鉴定方法和依据。本标准

2、适用于口岸植物检疫过程中鉴定松材线虫。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1松材线虫pinewoodnematode，PWN一种线形动物，隶属于动物界、线虫门(Nematoda)、侧尾腺纲(Secernentea)、垫刃目(Tylenchida)、滑刃科(Apelenchoidoidea)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)。能引起松树萎蔫病，是针叶树木上最重要的病原生物之一。2.2分散型3龄幼虫dispersallarva3，LIII松材线虫为扩散和度过不良生存环境，在寄主组织中出现的一种特定类型的3龄幼

3、虫。2.3持久型4龄幼虫dauerlarva4，LⅣ松材线虫为扩散传播，适应不良环境，在媒介天牛和寄主组织中出现的一种特定类型的4龄幼虫。2.4繁殖型3、4龄幼虫propagativelarva3andpropagativelarva4，L3，L4松材线虫正常生长和繁殖期出现的幼虫虫态。2.5雌虫早期youngfemale4龄幼虫刚完成蜕皮阶段而出现的早期松材线虫雌虫，具体表现为生殖系统发育尚未完全。3检疫原理松材线虫分布在被感染寄主的树体组织中，利用其在水中的活动性和密度大于水的特性，可以将寄主组织破碎后浸泡在水中，使松

4、材线虫从寄主组织中游离到水中，从而分离和获得松材线虫。利用甘油置换松材线虫体内的水，可以使松材线虫标本能保存较长时间，从而方便对标本进一步鉴定。依据松材线虫成虫头部、食道的形态特征、雌虫的阴门、尾端和雄虫交合刺、交合伞形状等稳定遗传的形态特征以及体长、体长／体宽比值等测计值，鉴定松材线虫。4仪器及用具4.1木工锯或电锯木工钻；4.2样品袋；4.3贝尔曼漏斗；4.4浅盘(筛盘、底盘)；4.5改进型漏斗分离器；4.6标准套筛(40目、400目、500目)；4.7显微镜(放大倍率40×～1000×，具目镜测微尺、绘图仪等)；4.

5、8体视显微镜(放大倍率10×～80×，具透射光源)；4.9超净工作台；4.10恒温培养箱；4.11恒温烘箱；4.12钟面皿(φ7cm，φ9cm)；4.13培养皿(φ7cm，φ9cm)；4.14酒精灯；4.15盖玻片；4.16载玻片；4.17线虫挑针；4.18控温电热平板。5药品和材料5.1指甲油5.20.1％硫酸链霉素(配方见附录A中A.6)；5.3TAF双倍液(配方见附录A中A.1)；5.4棉蓝-乳酚油(配方见附录A中A.2)；5.5福尔马林甘油液(配方见附录A中A.3)；5.6封片蜡(配方见附录A中A.4)；5.7PD

6、A培养基(配方见附录A中A.5)；5.8灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)。6现场检疫6.1直观检验对应施检疫物观察材质是否干燥，木质部有否蓝变，有无媒介昆虫栖居的痕迹，如侵入孔、蛀道、蛹室等。6.2抽样和取样6.2.1选取材质干燥无松脂香味、有蓝变、有媒介昆虫栖居痕迹的松木或其加工制品，若无上述特征时可随机抽样。抽样数量为每批总件数的0.5%～5%，最低不得少于三件，不满三件时全部抽取。6.2.2将所抽的样木锯成5cm左右的木段，或用木工钻多点钻取木屑(不得少于10g／份)，标号后即送样至实验室检验。6.2.3

7、取样时注意选取靠近虫道、蛹室的部位，钻取木屑时要注意先把取样部位的树皮剥净。6.2.4必要时可将样木整件带回实验室检验。7实验室检验7.1松材线虫的分离松材线虫分离方法见附录B。7.2线虫的镜检在体视显微镜下观察钟面皿中收集的线虫分离液，发现线虫后用挑针挑取或用50gL微量移液器吸取线虫并制成临时水玻片，在显微镜下观察。7.2.1临时水玻片的制作在载玻片上滴加一小滴水液(约50μL)，将线虫挑至水滴中央，沉底。从水滴正上方加盖玻片，在酒精灯上用1s的振幅周期通过10次左右，使线虫恰好被杀死。7.2.2每份样品的分离液中线虫

8、含量在20条以下的，全部制成临时水玻片境检；20条以上时，通过解剖镜观察选取各类各虫态线虫制片镜检，每类每虫态线虫至少镜检三条以上。7.3松材线虫的培养分离得到的松材线虫雌、雄成虫数量极少或仅发现幼虫时，须进行培养获得足够的雌、雄成虫，以进一步鉴定。培养方法见附录C。7.4松材线虫的虫体测计7.4.1标