NYT674-2003-转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化.pdf

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1、NY/T674-2003Hi吕本标准由农业部科技教育司提出。本标准起草单位:中国农业科学院生物技术所、中国农业科学院植物保护研究所、上海市农业科学院、农业部科技发展中心、中国农业大学。本标准主要起草人:贾士荣、金芜军、张大兵、彭于发、黄昆仑、李宁、汪其怀、罗云波。本标准首次发布。NY/T674-2003转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化范围本标准规定了转基因植物及其产品中DNA提取和纯化的方法和技术要求。本标准适用于转基因植物及其产品中DNA的提取和纯化。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不

2、包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673转基因植物及其产品检测抽样原理通过物理和化学方法使DNA从样品的不同组分中分离出来。利用不同的纯化方法，弃除样品中的蛋白质、脂肪、多糖及其他次生代谢物，及DNA提取过程中加人的三抓甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇和乙酸钠等，获得纯化的DNA.试剂与溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂;配制好的溶液经高温灭菌后使用。4.1澳代十六烷基三甲胺(cetyltri

3、methylammoniumbromide,CTAB),4.2三经甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris],4.3二水乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraaceticacid,disodiumsalt,dihydrate,EDTA-Na21-1}0).4.4E-琉基乙醇(E-mercaptoethanol)e4.5三氯甲烷(chloroform).4.6异戊醇(isoamylalcohol),4.7异丙醇(isopropylalcohol),4.8三抓甲烷+异戊醇=24+1(体积比)。4.976%乙

4、醇溶液:取760mL无水乙醇，加水定容至1L,4.1070%乙醇溶液:取700ml_无水乙醇，加水定容至11。4.11CTAB提取缓冲液I:配制每升CTAB提取缓冲液工，应在800mL去离子水中加人46.75g抓化钠，摇动容器使溶质完全溶解，然后加人50mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)仁在800mL去离子水中溶解121.1g三轻甲基氨基甲烷(Tris)，冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0(约需42mL浓盐酸)，加水定容至1L，分装后高压灭菌],20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)[在800mL水中加人186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(

5、EDTA-Na"2Hi0)，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠(NaOH)NY/T674-2003调节溶液的pH值至8.0(约需20g氢氧化钠颗粒)然后定容至1L，分装后高压灭菌〕，用水定容至1L,分装后高压灭菌。4.12CTAB提取缓冲液I:配制每升CTAB提取缓冲液I，应在800mL去离子水中加人46.75g抓化钠，20g澳代十六烷基三甲胺(CTAB)，摇动容器使溶质完全溶解，然后加入1mol/LTris-HCI(pH8.0)50mL,O.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL，用水定容至1L，分装后高压灭菌。4.13乙酸钠溶液:配制每升乙酸钠溶液，应在800

6、mL水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容至1L，分装后高压灭菌。4.14RNaseA:将10mg胰RNA酶溶解于987IaL水中，然后加人1mol/LTris-HCl(pH7.5)10pI[在800mL去离子水中溶解121.1g三经甲基氨基甲烷(Tris)，加人60mL浓盐酸，冷却至室温后调节pH值至7.5，加水定容至1L，分装后高压灭菌〕,5mol/L氯化钠3liL(在800mL水中溶解292.2g抓化钠，加水定容至1L，分装后高压灭菌)，于100℃水浴中保温15min,缓慢冷却至室温，分装成小份保存于一20'C。4.15TE缓冲液:

7、配制每升TE缓冲液，应在800mL水中依次加入1mol/LTris-HCI(pH8.0)10mL,O.5mol/I.EDTA(pH8.0)2mL，加水定容至1L，分装后高压灭菌。‘︺仪器和设备‘1︺通常实验室仪器设备。成，户J高速冷冻离心机(12000r/min).﹄匀，口高速台式离心机(12000r/min),‘月︺﹃紫外分光光度计。暇亡﹂︺磁力搅拌器。5.6高压灭菌锅。试验方法6.1试样的预处理6.1.1固态试样:待检测的固体试样研磨成颗粒状，颗粒的大小在2mm以下。6.1.2非油脂类液态试样，如面酱等粘稠状食品可直接用于DNA的提取。酱油、豆奶