NYT679-2003-猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法.pdf

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1、ICS11.220B41中华人民共和国农业行业标准NY/T679-2003猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法Enzymeimmunoassayforporcinereproductiveandrespiratorysyndrome2003-07-30发布2003-10-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T679-2003ol1吕本标准的附录A为规范性附录。本标准山农业部畜牧兽医局提出并归日。本标准起草单位:农业部兽医诊断中心。本标准主要起草人:土宏伟、王传彬、陈西钊、田克恭。NY/T679-2003猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法范围本标准规定了猪繁殖与呼

2、吸综合症(PRRS)免疫酶试验和免疫酶组织化学方法。本标准适用于检测猪血清中的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)抗体和组织中的PRRSV抗原2免疫酶试验2.，材料准备2.1.1试剂2.1.1.1磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.1章。2.1.1.2抗原涂片的制备:PRRSV接种于生长至70Y,-80%单层的Marc145细胞接种后3d-4d，病变达500%75%时，用胰蛋白酶消化分散感染的细胞单层,PBS洗涤三次后，稀释至1X700个细胞/ml取印有10个一40个小孔的室玻片，每孔滴加10阿室温自然干燥后，冷丙酮(40C)固定10min密封包装，置一20

3、℃备用2.1.1.3标准阳性血清:PRRSV试验感染猪制备的血清。2.1.1.4标准阴性血清:无PRRSV感染、未经免疫的猪血清2.1.1.5酶结合物:辣根过氧化物酶(HRP)标记的葡萄球菌A蛋自(SPA)2.1.1.6底物溶液:配制见第A.2章。2.1.2器材a)普通光学显微镜;b)印有10个一4。个小孔的室玻片;c)微量加样器，容量5川一50川;d)37℃恒温培养箱或水浴箱.2.1.3样品采集被检猪血液，分离血清血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一300C保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS作10倍稀释2.2操作方

4、法2.2.，取出抗原涂片，室温干燥后，滴加10倍稀释的待检血清和标准阴性血清、标准阳性血清，每份血清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，370C30min,2.2.2PBS漂洗三次，每次5min,室温干燥2.2.3滴加适当稀释的酶结合物，置湿盒内，370C30mine2.2.4PBS漂洗三次，每次5min2.2.5将室玻片放人底物溶液中，室温下显色5min--10min.PBS漂洗两次，再用蒸馏水漂洗一次。2.2.6吹干后，在普通光学显微镜下观察，判定结果。2.3结果判定2.3.1在阴性血清对照、阳性血清对照成立的情况下:即阴性血清与正常细胞和病毒感

5、染细胞反应均无色;阳性血清与正常细胞反应无色，与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判定结果;否则应重试。2.3.2待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色，即可判为PRRSV抗体阴性。2.3.3待检血清与正常细胞反应呈无色，而与病毒感染细胞反应硅棕黄色至棕褐色，即可判为NY/T679-2003PRRSV抗体阳性.3免疫酶组织化学法3.1材料准备3.1.，试荆3.1.1.1磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第八.1章。3.1.1.2标准阳性血清PRRSV实验感染猪制备的血清3.1.1.3标准阴性血清:无PRRSV感染、未经免疫的猪血清。3.1.1.4酶结合

6、物:HRP标记的SPA3.1.1.5底物溶液:配制见第A.2章。3.1.1.6过氧化氢甲醇溶液:配制见第A.3章3.1.1.7盐酸酒精溶液:配制见第A.4章3.1.1.8胰蛋白酶溶液;配制见第A.5章。3.1.2器材a)普通光学显微镜;h)微量加样器，容量50tL-200BL;c)石蜡切片机或冷冻切片机;d)载玻片及盖玻片;e)37'C恒温培养箱或水浴箱。3.1.3样品对疑似PRRS的病死猪或扑杀猪，立即采集肺、扁桃体和脾等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即送检者，将组织块切成1cmxlcm左右大小，置体积分数为10%的福尔马林溶液中固定，保存，送检3.

7、2操作方法3.2.1新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片风干后用丙酮固定10min-15min;新鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片，常规脱蜡至PBS(切片应用白胶或铬矾明胶做粘合剂，以防脱片)。3.2.2去内源酶:用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精37℃作用20mine3.2.3胰蛋白酶消化:室温下，用胰蛋白酶溶液消化处理2min，以便充分暴露抗原。3.2.4漂洗:PBS漂洗三次每次5min.3.2.5封闭:滴加体积分数为5%的新生牛血清或l，10稀释的正常马血清，37℃湿盒中作用30min,3.2.6加适当稀释的标准阳性血清或标准阴性血清,370C湿盒

8、中作用1h或370C湿盒中作用30min后4℃过夜。