NYT539-2002-副结核病诊断技术.pdf

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1、ICs11.220B41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T539-2002副结核病诊断技术Diagnostictechniquesforparatuberculosis2002一08一27发布2002门2一01实施中华人民共和国农业部发布Nv/T539-2002前言副结核病(paratuberculosis,lohne'sdisease)是由副结核分枝杆菌(mycobacteriaparatuberculosis)引起的以反当动物为主的一种慢性、消耗性传染病，其临床症状以持续性腹泻和慢性消瘦为特征

2、。该病广泛地分布于世界各国，引起较大的经济损失。世界动物卫生组织[WorldOrganizationforAnimalHealth(英),OfficeIntentionaldesEpizootic(法),OIE〕将其划为B类传染病，我国也将其划为I类传染病。副结核病潜伏期长，有的终生感染而不表现出临床症状。至目前为止，尚无治疗该病的有效方法，防治该病的主要方法是监测、隔离和淘汰病畜。目前该病的检疫方法有细菌学检查和免疫学检查。后者主要是包括皮内变态反应、琼脂扩散试验、间接红细胞凝集试验、淋巴细胞转化试

3、验、补体结合反应和酶联免疫吸附试验(ELISA)。本标准提出的补体结合反应、皮内变态反应和ELISA方法与OIE推荐的可选择方法基本一致。本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:吉林农业大学、吉林省兽医研究所。本标准起草人:何昭阳、吴玉环、顾万钧、钱爱东。NY/T539-2002副结核病诊断技术1范围本标准规定了副结核病的诊断技术。本标准的细菌学检查、皮内变态反应、补体结合反应适用于牛、羊、鹿等动物的副结核

4、病诊断;ELISA检疫方法适用于牛的副结核病诊断。2细菌学检查2.，材料准备。.5%氢氧化钠液、水浴糟、离心机等。抗酸染色法试剂:配制及染色方法见附录A,2.2操作方法取待检粪样(尽可能取带有粘液或血丝的粪便)15g-20g，加约3倍量的0.500氢氧化钠液，混匀，55'C水浴乳化30min,以4层沙布过滤，取滤液1000r/min离心5min，去沉渣后，再以3000r/min4000r/min离心30min，去上清，用沉淀涂片。也可以直肠刮取物、病变肠段粘膜直接涂片。火焰固定，抗酸染色(见附录A)后

5、镜检。2.3结果判定发现在细胞内有被染成红色、成丛排列的短杆菌即为细菌检查阳性(+)，否则判为细菌检查阴性(一)。3皮内变态反应试验3.1材料准备3.1.1器材游标卡尺、灭菌的1mL注射器及针头、了5%酒精棉、记录本等。3.1.2变应原副结核分枝杆菌提纯蛋白衍生物(副结核PPD)或禽分枝杆菌提纯蛋白衍生物(禽结核PPD),3.2操作方法3.2.1将被检动物编号，在颈侧中三分之一处中部的健康皮肤处剪毛，直径约10cm，将注射部位的皮肤用手捏起，以卡尺测量皮肤皱褶厚度并记录。局部消毒。3.2.2将变应原以

6、灭菌生理盐水稀释至。5mg/mL，与皮肤呈150^-200的角度进行皮内注射。注射后注射部位应呈现绿豆至黄豆大小的小包。无论动物种类及大小一律皮内注射0.1mL。如注至皮下或溢出，应于离原注射点8cm以远处补注一针，并在记录中加以说明。3.2.3羊在尾根无毛的皱褶部进行皮内注射。3.3结果判定注射72h观察反应，检查注射部位有无热、肿、痛等炎性反应，并以卡尺测量注射部位的皮肤皱褶厚度。3.3.1判定标准如下:a)变态反应阳性(十):局部有炎性反应，皮厚差)4mm.NY/T539-2002b)变态反应疑

7、似士局部炎性反应不明显，皮厚差2.1mm-3.9mmc)变态反应阴性(一)局部无反应或炎性反应不明显，皮厚差《2.0mm,3.3.2羊有反应者(不论皮厚差大小和炎性反应轻重)判为变态反应阳性(+)，无任何反应者判为变态反应阴性(一)3.3.3变态反应疑似，应于3个月后复检，于注射部位对侧的相应部位进行皮内注射，72h后仍判为变态反应疑似，则判为变态反应阳性。4补体结合反应试验4.1材料准备4.1.1器材12mmX37mm小试管、试管架、刻度吸管等。4.1.2试剂3%绵羊红细胞悬液:采集绵羊红细胞放于阿

8、氏液中，4'C保存。使用时，以生理盐水洗涤3次，最后一次要求2500r/min离心15min，弃上清得红细胞泥，以生理盐水配制成体积分数为3写的绵羊红细胞悬液。溶血素、补体、禽分枝杆菌提取的脂多糖抗原、标准阳性血清、标准阴性血清等。4.2操作方法4.2.1预备试验4.2.1.1溶血素效价测定取溶血素。.2mL(商品溶血素加有等量的甘油)，加人9.8mL生理盐水，即为1，100稀释，再按表1进行稀释和表2进行溶血素效价测定。表，溶血素稀释表单位为毫升试管号