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1、上海交通大学硕士学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日4上海交通大学硕士学位论文用基因芯片技术分析川芎嗪对小鼠溃疡性结肠炎的影响摘
2、要背景及目的炎症性肠病（IBD）包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），是免疫、遗传、环境及肠道细菌等多因素、多环节相互作用的结果，由于病因不明,临床上常常表现反复发作而治愈难度大。近年来在CD的治疗研究上取得了较大的进展，几种特异性免疫生物制剂的疗效相继得到肯定。与此同时，对在我国发病率更高的UC的研究却大大滞后，一方面原因在于UC的动物模型制取不易，本实验选用恶唑酮结肠炎模型,为Th2型炎症,其组织学特征和炎症分布均类似人类。另一方面，虽然在运用某些特异性免疫生物制剂包括中医药手段来干预细胞因子网络以治疗UC上也有很多尝试，但检
3、测指标多集中于单一或数个分子上，取材种类也较少，从而使得数据较为单薄，难以完整解释药物的作用机制。本实验用基因芯片表达谱技术分析川芎嗪对小鼠溃疡性结肠炎的影响，对川芎嗪药物的作用机制做出综合评价，旨在进一步了解溃疡性结肠炎的发病机制及提高中药疗效提供有益的思路，为UC的动物模型选取和药物筛选研究提供实验依据。方法1建立小鼠溃疡性结肠炎模型及川芎嗪体内药物干预将40只健康昆明小鼠随机分为4组：正常对照组（10只）、模型对照组（10只）、生理盐水组（10只）、川芎嗪组（10只）；除正常组外，其他动物均建立恶唑酮诱导的结肠炎模型：小鼠背部皮肤
4、滴注3%恶唑酮（溶解于100%乙醇中）0.2mL；1d后重复滴注1次。4d后将硅胶管从肛门插入小鼠肠道深约4cm,注入0.5%恶唑酮（溶解于50%乙醇中）0.15mL。灌肠后第2d起对3组动物分别不处理、腹腔注射生理盐水100ul和川芎嗪8mg/kg（以100ul生理盐水稀释）。连续治疗7d后处死所有动物。取离体新鲜结肠组织，-80℃保存。2结肠组织大体形态和组织学评分取各组小鼠肛门至盲肠段结肠(约8cm)沿肠结膜纵轴剪开,冷生理盐水冲洗干净,用放大镜观察大体形态改变,按无损伤0分,黏膜充血1分,溃疡面积≤受8上海交通大学硕士学位论文损
5、面积25%2分,溃疡面积为受损面积25%～50%3分,溃疡面积≥受损面积50%4分,为标准评分。取肠组织一部分以10%福尔马林固定,石蜡包埋,HE染色镜下评价炎症和溃疡,结肠组织学损伤评分指标包括溃疡、肉芽肿,纤维化按有无及轻重计为0、1、2分,病变深度(达粘膜下层1分、肌层2分、浆膜层3分),各项相加得总分。2小鼠基因芯片实验方法小鼠结肠样本总RNA抽提按TRIZOLRNA提取试剂盒说明书提取各样本总RNA，取等量结肠组织RNA分别于组内混合。用琼脂糖凝胶电泳及Lab-on-chip系统对样品总RNA进行质量检测和定量。探针制备采用
6、QIAGENRNeasyKit（QIAGEN公司，CatNo.74106）分离纯化总RNA。mRNA经过逆转录标记cDNA探针并纯化，cDNA第一链和第二链一步法合成，参入荧光标记NTP，用Cy3-NTP标记盐水对照组结肠cDNA，用Cy5-NTP标记川穹嗪组结肠cDNA。芯片杂交和扫描采用小鼠基因芯片为Mouseoligomicroarray（Agilent公司，目录号：G4112A）。芯片的杂交、洗脱、染色均在Agilent公司专用设备Agilent杂交炉（型号:G2545A）中完成。用Agilent激光共聚焦扫描仪（型号:G265
7、5AA）对杂交结束后的芯片进行扫描。数据读取与标准化处理图像直接使用Agilent系统相应的图像分析软件FeatureExtraction进行定量分析处理。通过对荧光、背景和标准化方式（Linear&Lowess）等参数的设定，图像定量和数据标准化处理一步完成。ratio值为cy3/cy5，差异基因筛选标准为Ratio(Cy3/Cy5)>=2或<=0.5，Flag为0，SN>2.6，pValueLogRatio<0.05。最后使用genespring和cluster分析软件进行基因聚类分析。4统计学方法所有数据均以统计软件SPSSV13
8、.0进行处理分析，大体评分和组织学以均数±标准差（x±s）表示，大体评分和组织学评分采用成组设计的两样本均数比较的9上海交通大学硕士学位论文t检验,,定义P<0.05为差异有统计学意义。结果1模型制备结果模
