GBT4789.12-1994-食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验.pdf

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1、GB4789.12—1994中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验MicrobiologicalexaminationoffoodhygieneExaminationofClostridiumbotulinumandbotulinustoxinGB4789.12—19941主题内容与适用范围本标准规定了肉毒梭菌及肉毒毒素的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中肉毒梭菌及肉毒毒素的检验。2引用标准GB4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料3．1离心机及离心管。3．2研钵及细沙。3．3温箱：30℃，35℃，37℃。3．4显

2、微镜。3．5厌氧培养装置：常温催化除氧式或焦性没石子酸除氧式。3．6吸管：1mL，10mL。3．7注射器：1mL。3．8平皿。3．9接种环。3．10载玻片。3．11小白鼠。4培养基和试剂4．1庖肉培养基：GB4789.28中4.67。4．2卵黄琼脂培养基：GB4789.28中4.68。4．3明胶磷酸盐缓冲液：GB4789.28中3.23。4．4肉毒分型抗毒诊断血清。4．5胰酶：活力1：250。4．6革兰氏染色液：GB4789.28中2.2。5检验程序肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序如下：注：①报告（一）：检样含有某型肉毒毒素。②报告（二）：检样含有某型肉毒梭菌。③报告（三）：由样品

3、分离的菌株为某型肉毒梭菌。如上所示，检样经均质处理后，及时接种培养，进行增菌、产毒，同时进行中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施GB4789.12—1994毒素检测试验。毒素检测试验结果可证明检样中有无肉毒毒素以及有何型肉毒毒素存在。对增菌产毒培养物，一方面做一般的生长特性观察，同时检测肉毒毒素的产生情况。所得结果可证明检样中有无肉毒梭菌以及有何型肉毒梭存在。为其他特殊目的而欲获纯菌株，可用增菌产毒培养物进行分离培养，对所得纯菌株进行形态、培养特性等观察及毒素检测，其结果可证明所得纯菌为何型肉毒梭菌。6操作步骤6．1肉毒毒素检测液状检样可直接离

4、心，固体或半流动检样须加适量（例如等量、倍量或5倍量、10倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后离心，取上清液进行检测。另取一部分上清液，调pH6.2，每9份加10%胰酶（活力1：250）水溶液1份，混匀，经常轻轻搅动，37℃作用60min，进行检测。肉毒毒素检测以小白鼠腹腔注射法为标准方法。6．1．1检出试验：取上述离心上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠2只，每只0.5mL，观察4d。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h内发病、死亡。主要证状为竖毛，四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以至症状不明显时，则

5、可将注射液做适当稀释，重做试验。6．1．2确证试验：不论上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小鼠发病、死亡者，取样分成3份进行试验，1份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀，37℃作用30min，1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min；1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可，不做其他处理。3份混合液分别注射小白鼠各2只，每只0.5ml,观察4d,若注射加诊断血清与煮沸加热的2份混合液的2份混合液的小白鼠均获保护存活，而唯有注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有症状死亡，则可判定检样中有肉毒毒素存在，必要时要进行毒力测定及定型试验。6．1．3毒力测定：取已判定含有肉毒毒素的

6、检样离心上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成50倍、500倍及5000倍的稀释液，分别注射小白鼠各2只，每只0.5mL，观察4d。根据动物死亡情况，计算检样所含肉毒毒素的大体毒力（MLD/mL或MLD/g）。例如：5倍、50倍及500倍稀释致动物全部死亡，而注射5000倍稀释液的动物全部存活，则可大体判定检样上清液所含毒素的毒力为1000～10000MLD/mL。6．1．4定型试验：按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含肉毒毒素的毒力大体在10～1000MLD/mL的范围，分别与各单型肉毒抗诊断血清等量混匀，37℃作用30min，各注射小鼠2只，每只0.5mL，观

7、察4d。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素液等量混合作为对照。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。注：①未经胰酶激活处理的检样的毒素检出试验或确证试验若为阳性结果，则胰酶激活处理液可省略毒力测定及定型试验。`②为争取时间尽快得出结果，毒素检测的各项试验也可同时进行。③根据具体条件和可能性，定型试验可酌情先省略C、D、F及G型。④进行确证及定型等中和试验时，检样的稀释应参照所用肉毒诊断血清的效价。中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施G