GBT28071-2011-黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65．020．01B16香雪中华人民共和国国家标准GB／T28071--2011黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法Detectionandidentificationofcucumbergreenmottlemosaicvirus2011-12-30发布2012-06-01实施宰瞀髁紫瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会促19标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖吾GB／T28071—2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC

2、／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：陈青、陈红运、廖富荣、林石明、吴冰冰、冯黎霞、张永江。标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法GB／T28071—2011本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法。本标准适用于可能携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子、苗木及其产品的检疫鉴定。2黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息中文名：黄瓜绿斑驳花叶病毒。学名：cucu

3、mbergreenmottlemosaicvirus。缩写：cGMMv。属烟草花叶病毒属Tobamovirus成员。CGMMV可通过接触传播，也可通过种子传播。蚜虫等常见瓜类病毒的传播介体不能传播CGMMV。嫁接等农事操作是田间病害流行的主要因素之一。植株一旦发病，如果未进行杀灭处理，土壤也可带毒，带毒土壤也可成为病害发生的侵染源。黄瓜绿斑驳花叶病毒的其他信息参见附录A。3方法原理通过基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式

4、反应(RT-PCR)，并根据生物学特性进行检测鉴定。4仪器设备、用具及试剂4．1仪器设备洗板机、酶联检测仪、高速冷冻离心机、电子天平(感量0．001g)、超净工作台、旋涡混合仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仅、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅。4．2用具微量移液器(0．5弘L，2pL，10pL，20pL，100,uL，200pL，1000pL)、化学PGR反应管和(或)96孔光化学PCR反应板、酶联板、研钵。4．3试剂4．3．1酶联测定试剂(见附录B)。4．3。2RT-PCR检测试

5、剂(见附录C)。4．3．3实时荧光RT-PcR检测试剂(见附录D)。4．3．4生物学测定(参见附录E)。1标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28071—20”5样品制备5．1种子样品制备及检疫鉴定挑取500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中，待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。采集的叶片分成两份，分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。5．2苗木检验鉴定有症状的

6、苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同5．1。5．3植物产品的检验鉴定植物产品有症状的部分(如：果实上的畸形、斑驳等)单独检测。没有症状或无法观察症状的植物产品，应按比例取样，检测方法为酶联测定和分子生物学检测。6检测方法6．1双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加入已包被CGMMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料(如种子

7、或叶片)应尽量与检测样品一致。具体操作见附录B。6．2RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成eDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。6．3实时荧光RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，进行实时荧光RT-PcR检测。健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录D。6．4生物学接种试验参见附录E。7结果判定6．1、6．2、6．3、6．4中如

8、果两种方法的检测结果为阳性，即可判断该批种子或苗木携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。一般是酶联测定为阳性后，RT—PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性即可判断为携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。必要时可进行生物接种试验。2标准分享网www.bzfxw.com免费下载8样品保存GB／T28071—2011经检验确定携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4℃，病株在--20℃或者--80℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。9结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、