《GB7918.4-1987-化妆品微生物标准检验方法绿脓杆菌》.pdf

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1、中华人民共和国国家标准UDC668.58:576化妆品微生物标准检验方法.85.07绿脓杆菌GB7918.4一87StandardmethodsofmicrobiologicalexaminationforcosmeticsPseudomonpsaeruginosa绿脓杆菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。对人有致病力，常引起人皮肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症，因此，在化妆品卫生标准中规定不得检出绿脓杆菌。1方法提要根据本菌生物学特征:革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸

2、盐，在42℃条件下生长等，可与类似菌相区别。2培养墓和试剂2.1SCDLP液体培养基见GB7918.1-87《化妆品微生物标准检验方法总则》。2.2十六烷三甲基澳化馁培养基成分:牛肉膏3g蛋白陈log氯化钠5g十六烷三甲基澳化按0.3g琼脂20g蒸馏水1000m1制法:除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调PH为7.4-7.6，加入琼脂，115'C(101b)20min灭菌后，制成平板备用。2.3乙酞胺培养基成分:乙酸胺10.Og氯化钠5.0g无水磷酸氢二钾1.39g无水磷酸二氢钾0.73g硫酸镁(MgSO,·7H,O)0.5g酚红0.012g琼脂20g蒸馏水1000m1制法

3、:除琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解，调PH为7.2，加入琼脂、酚红，121C中华人民共和国卫生部1987一05一28批准1987一10一01实施GH7918.4一87(15lb)20min高压灭菌后，制成平板备用。2.4绿脓菌色素测定用培养基成分:蛋白陈20g抓化镁1.4g硫酸钾108琼脂18g甘油(化学纯)log燕馏水l000ml制法:将蛋白陈、抓化镁和硫酸钾加到蒸馏水中.加温使溶解，调州至7.4.加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115'C(101b)20min高压灭菌后，制成斜面备用。2.5明胶培养基成分:牛肉膏39蛋白陈5g明胶120g蒸馏水1

4、000ml制法:取各成分加在燕馏水中浸泡20min,随时搅拌加温使溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经115'C(101b)20min灭菌后，直立制成高层备用。2.6硝酸盐蛋白陈水培养基成分:蛋白陈log酵母浸青3吕硝酸钾2g亚硝酸钠0.5g燕馏水loooml制法:将蛋白陈和醉母浸膏加到蒸馏水中，加温使溶解，调pH为7.2,煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115'C(101b)20min灭菌后备用。2.了普通琼脂斜面培养基成分:蛋白陈log牛肉青3g抓化钠5g琼脂15g蒸馏水loooml制法:除琼脂外，将其余成分溶解于燕馏水中

5、，调叫为7.2-7.4，加入琼脂，加热溶解，分装试管，121'C(151b)15min高压灭菌后。制成斜面备用。3仪器3.1培养箱:37'C.42C。3.2锥形烧瓶。3.3试管。5.4灭菌平皿3.5灭菌刻度吸管3.6显微镜。3.7载玻片。3.8接种针、接种环。144GB7918.4一87电炉。:.{。高压消毒锅。4操作步吸4.1增菌培养:取1:10样品稀释液lOml加到90mlSCDLP液体培养基中，置37℃培养18-24h,如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。注:如无SCDLP液体培养基时，可用普通肉汤培养基。植脸含防腐剂的化妆品时，在每

6、1000.1普通肉汤中加1g卵磷脂,7g吐温80,4.2分离培养:从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基澳化按琼脂平板上，置37℃培养18-24h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。在缺乏十六烷三甲基澳化按琼脂时也可用乙酞胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平皿中，放37℃培养24h，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不生长4.3染色镜检:挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏

7、染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。4.4氧化酶试验:取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻瑞棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲荃对笨二胺试液，在15-30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴性.4.5绿脓菌素试验:取可疑菌落2-3个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，置37'C培养24h，加入氯仿3-5ml，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于抓仿液内，待抓仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1N的盐酸1ml左