2.2kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体特异性新蛋白的功能研究论文

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3、持续性感染及致病性相关。本研究着眼于这两种剪接变异体编码的两种不同的剪接特异性新蛋白，拟用酵母双杂交的方法，寻找能够与它们相互作用的细胞蛋白，从而探索它们的致病性。本研究第一部分从临床标本中分离获得双剪接型与单剪接型2．2Kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体，在此基础上构建了双剪接型剪接变异体特异性新基因(TPds基因)与单剪接型剪接变异体特异性新基因(TP船基因)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-TPds、pGBKT7．TPss。在酵母双杂交实验过程中，发现TPds具有反式激活GAL4反应元件的能力：而TPss则没有这一功能。本研究的第二部分旨在深入探讨TPds的反

4、式激活作用．利用分段克隆的方法，确定了TPds蛋白反式激活的主要功能区域位于其中部的28个氨基酸，此28个氨基酸编码框符合preSl第30--57位氨基酸，从剪接体的角度阐明了具有致病意义的preSl相关蛋白的第二种来源。进一步构建TPds蛋白的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3．1／HisC-TPds，证实了该蛋白在肝细胞中对CMV即刻早期启动子、SV40启动子，增强子也具有反式激活作用，同时还证实了该蛋白对HBV自身启动子，增强子也具有刺激作用．本研究的第三部分利用酵母双杂交系统筛查肝细胞中与TPss蛋白相互作用的细胞蛋白，获得四种候选蛋白：组织蛋白酶B、微粒体

5、环氧化物水解酶、组织蛋白酶D、纤维蛋白原T链；并通过哺乳动物细胞双杂交实验验证了它们与TPss蛋白在肝癌细胞Huh7中的相互作用；提示TPss可能影响肝细胞凋亡与肿瘤的侵袭转移，并可能影响肝组织的解毒功能与凝血功能。关键词：乙型肝炎病毒RNA剪接反式激活启动子酵母双杂交Investigationonfunctionofthenovelproteinsencodedbythe2．2KbsplicedvariantsofhepafitisBvirusgenomeAbstractSplicedvariantsofhepatitisBvirusgenomesareagro

6、upofsubgenomiclengthDNAgeneratedfrom3．5KbpregenomicRNAbysplicingandreversetranscription．Morethan80％ofthesesplicedvariantsare2．2KbdoublyorsinglysplicedvariantsofhepatitisBvirusgenome，whichcouldencodesplicing—specificptDtcinsandcloselyrelatedwitlIpersistentinfectionandpathogenicityofHBV

7、．TheaimofthisstudywastOexplorepotentialpathogenicityofsplicing-specificproteinsencodedbythe2．2KbdoublyorsinglysplicedvariantsofHBVbyyeasttwo-hybridsystem．Inthefirstpartofthisstudy,2．2KbdoublyOrsinglysplicedvariantsofhepatitisBvirusgenomewereseparatedfromtheserumoflivercarcinomapatient

8、sandc