基因工程期末考试重点知识整理

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1、基因工程第一章基因工程概述1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT)基因工程（GeneEngineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术.2、基因工程的历史基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：PaulBerg及其同事PPT基因工程诞生：1973，Cohen&B

2、oyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化基因工程发展阶段的几个重要事件：一系列新的基因工程操作技术的出现；各种表达克隆载体的成功构建；一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现3、基因工程的内容（P9）4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)第二章分子克隆工具酶5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答)概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内特点（参加PPT）命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如

3、：从HaemophilusinfluenzeRd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为HindⅢ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ6、几个基本概念粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列

4、的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：ATCGAT；AccI：GTCGAC星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。DNA物理图谱：（多为质粒图谱）7、大肠杆菌中甲基化酶的种类①Dam甲基化酶，在序列GATC中A的N6位置引入甲基。②Dc

5、m甲基化酶，dcm基因表达胞嘧啶甲基化酶，它能特异性识别DNA双链上的CCA(T)GG序列，并使第二个C5甲基化，即CmCWGG，避免DNA受到相关限制酶的切断。dcm基因的变异导致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源DNA上的C不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。③EcoKI甲基化酶；④SssI甲基化酶8、依赖于甲基化的限制系统（McrA,McrBC,Mrr）依赖于甲基化的内切酶E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统①mcrA基因表达E.coli防御体系中起重要作用的McrA酶，该酶能特异性地作用于外来DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列，即C5mCGG

6、特异序列，使之分解，对大肠杆菌本身起保护作用。mcrA基因的变异，导致上述功能缺失，对外来DNA中被甲基化的胞嘧啶特异序列（C5mCGG）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的克隆体的稳定。②mcrB,C基因表达McrB和McrC两种特异性蛋白，它们在E.coli的防御系统中起重要作用。一般情况下，只有这两种蛋白同时存在时才表现出活性，McrC具有识别和调节功能，它能特异性的结合到外源DNA被甲基化的胞嘧啶的特异序列G5mC上，然后由McrB蛋白切断（McrB蛋白是特异性切断外来DNA中G5mC序列的限制性核酸内切酶)，防御外来DNA的侵入。③mrr基因

7、是大肠杆菌细胞防御系统中重要的基因之一，它能严格限制被甲基化的外源DNA的介入。另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆体。9、几个基本概念DNA聚合酶，以单链DNA为复制模板，由5'端开始复制到3'端的酶。催化DNA的合成（具备模板、引物、dNTP等）及其相辅的活性。反转录酶，依赖于RNA的DNA聚合酶,有5’-3’合成DNA活性,无3’-5’外切核酸酶活性（RNaseH水解磷酸二酯键，剪断mRNA，cDNA第二条链合成）。来自AMV(禽成髓细胞瘤病毒)或M-MuLV(鼠白血病病毒)RNA聚合酶，识别DNA中启动子特异序列，合成RNA

8、，无需引物。连接酶①T4DNA连接酶，反应底物:黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA②大肠杆菌DNA