dig-southern检测试验报告20101031

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1、1实验结果报告单来样单位农科院郎志宏老师委托项目Southern检测报告完成时间2010年10月31日实验流程、所用试剂、耗材:1.DIGD-110"地髙辛杂交检测试剂盒I(化学显色法)”：北京美莱博医学科技有限公司;2.PDLK-010“PCR法DIG标记试剂盒”：北京美莱博医学科技有限公司；3.EcoRI内切酶，HindIII内切酶：Fermentas(MBI)公司；4.6xDNA电泳上样缓冲液：北京美莱博医学科技有限公司；5.Taq酶：北京美莱博医学科技有限公司；6.1KbPlusDNALadder：美国Fermentas(MBI)；7.10mMdNTP：北京美莱博医学科技有限

2、公司；8.DL2000分子量标准：北京美莱博医学科技有限公司；9.琼脂糖：西班牙Biowest公司；10.AXYGEN耗材：10^1/200^1/1OOOpI无RNA酶吸头；0.2ml薄壁PCR管；二、实验所用仪器：1、TakaraTP600型梯度PCR仪：日本Takara公司；2、H1650-W台式微量高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；3、超净工作台：北京鑫宏程洁净工程技术有限公司4、紫外交联仪：新芝生物科技股份有限公司；5、电泳仪：上海申能博彩生物科技有限公司6、分子杂交炉：新芝生物科技股份有限公司；7、电泳槽：JY-SP-B型，北京君意东方电泳设备有限公司；8、电泳仪：上

3、海申能博彩生物科技有限公司；9、凝胶紫外分析仪：JY02S型，北京君意东方电泳设备有限公司；10、移液器：2.5pl/100pl/200pl/1000pl,Eppendorf公司三'探针制备：1、扩增体系：10Xbuffer(pIusMg"):2ulDIG-dUTP标记混合物：1ul引物F:1ul引物R:1ulTaq酶：1ul模板：1ulddH20：13ul2、扩增程序:5min30s95°C95°C60°C72°C72°C4°C30eyeIes30s30s7min10min3、扩增结果：M:DL20001:标记的探针2：对照取扩增产物各4（il,DL2000分子量标准5川/泳道。1

4、%琼脂糖凝胶120V电压下电泳25mino用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。五、基因组DNA酶切1酶切体系:10Xbuffer:7ulEcoRI内切酶：6uI样品DNA:55ul补足水至70ul10Xbuffer:7ulHindIII内切酶：6uI样品DNA：55ul补足水至70ul于37°C温箱中酶切20ho2、电泳琼脂糖、1%胶浓度、TBEbuffer（EB染料电泳后染）3、电泳结果101OOOO-M:1KBDNALadder；1:2(EcoRI):2：2(HindIII);3：7(EcoRI);4：7(Hindlll);5：15(EcoRI);6：15(Hindlll);7：17

5、(EcoRI);8：17(HindIII);9：52；10：52；11：+CK；六、转膜1、将胶裁成9.5X11.5cm大小，于平皿中用蒸馅水冲洗一次。2、加入100ml0.25mol/L的盐酸脱嚟哙,室温振荡30mino再加入变性液(1.5mol/LNaCK0.5mol/LNaOH)室温振荡30min。3、用蒸徭水冲洗2次。加入中和液(1.5mol/LNaCI、1.0mol/LTris-CI,pH7.4)室温振荡2X15mino4、用蒸馆水冲洗2次。加入2XSSC平衡凝胶和硝酸纤维素膜5mino5、转膜(向上毛细管法，参照《分子克隆》)26小时。取下膜作好标记，在2XSSC中漂洗一

6、次，UV交联仪上照射固定DNA(5000pJ/cm2)o6、取出后标记对应分子量标准位置。七、杂交1、预杂交：取11.0mlHyb高效杂交液(Hyb-100),加入杂交管中，60°C杂交炉中预杂交2ho2、探针变性：探针在PCR仪中100°C变性10分钟，立即放冰水浴冷却5mino3、杂交：排尽预杂交液，在11.0mlHyb高效杂交液(Hyb-100)加入6.0山新变性好的探针，混匀。60°C杂交仪中杂交过夜。八、洗膜、信号检测C使用美莱博DIGD-110“地高辛杂交检测试剂盒I(化学显色法)”)1、杂交后室温下，20ml2XSSC/0.1%SDS洗膜2X5mino2、50°C,20

7、ml0.1XSSC/0.1%SDS洗涤2X15mino3、再将膜置于20ml洗涤缓冲液中平衡2-5mino4＞将膜在10ml封闭液中封闭30min（在摇床上轻轻摇动）。5、Anti-Dig-AP在lOOOOrpm下离心5mino离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释（1：5000）,2.OuIAnti-Dig-AP加入10ml封闭液混匀。6、封闭完成后倒出封闭液，加入稀释好的10ml抗体溶液，浸膜至少30mino7、去除抗体溶液，用20ml洗涤缓冲液缓