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《抗癌1号和抗癌2号对肝癌细胞生长抑制作用的实验研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、抗癌1号和抗癌2号对肝癌细胞生长抑制作用的实验研究林洁黄晓敏龙毅陆晓峰梁海燕李红妃银彩林张树球(通讯作者)(右江民族医学院重金属与氟碑毒物研究实验室广西百色533000)【摘要】目的探讨中药抗癌1号和抗癌2号对肝癌细胞凋亡的影响。方法用1640培养基培养肝癌细胞(Hepg2)分别加入不同的抗癌中药一起培养,并设一组标准抗癌药和一组不加中药的培养。培养5d后,在倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍摄图片分析,收集细胞计数。结果抗癌1号、抗癌2号、三尖杉和对照组细胞计数分别为1644.0±404.1、2345.0±169.
2、5、2373.5±542.7>3410.3±377.3万个/ml,对照组明显高于其他组(P<0.05,P<0.01);加药三个组细胞均表现粗糙、颗粒多、易剥落凋亡现象。结论抗癌1、2号和对照药物对肝癌细胞牛长均有明显的抑制作用,促进癌细胞凋亡。【关键词】肝癌细胞抗癌药抑制作用抗癌一号是中草药肿节风为主要的复方合剂,经木课题组长期临床使用观察对肝癌患者有较好的疗效。文献报道[1,2],肿节风临床使用和实验研究也有较好的抗癌效果。为进一步探讨木方的抗癌效果和作用机理,木文实验与肝癌细胞HepG2为研究对象,在实验
3、培养的条件下,加进木药后观察其生长情况、计数细胞、细胞变化、凋亡等,并用抗癌2号、三尖杉(3)、不加药对照,分析药物的作用效果。现将实验结果报道如下。1试剂与方法1.1试剂进口1640培养基(RPMIMedium1640)>碳酸氢钠、盐酸、青霉素(80万u/瓶)、链霉素(1"瓶)、HepeS试剂、三蒸谓水(去离子水)、胰蛋白酶、PBS缓冲液、重銘酸钾洗液、二甲基亚砚、乙醇、新洁尔灭。1.2仪器与设备:细胞培养室(无菌)、二氧化碳培养箱(美国热电公司产品)、倒置显微镜(上海光学仪器厂)、超净工作台(苏州产品)、-86°C超低温冰箱(美国热电公司
4、产品)、恒温水浴锅、低速离心机、干燥箱、高压灭菌器(山东产品)、显微照相机(索尼产品)。玻璃细胞培养瓶、细胞计数板、吸管、移液器等。1.3试剂配制1.3.11640液体培养基。原装(RPMIMedium1640)1640一小包,加三蒸水1000ml溶解稀释,用NaHCO3、lmol/IHCLHepeS调PH7.2—7.4,加青霉素至100u/ml>链霉素至100u/ml/,用过滤器过滤除菌。放4°C冰箱保存待用。1.3.20.25%胰蛋白酶配制:称胰蛋白酶0.25g,加D—HankS液100ml,放4°C冰箱溶解4h,调PH7
5、.4—7.8,过滤除菌,分装,放-20°C冰存。1.3.3PBS储存(10x)配制:NaCI8.5g,KCI0.2g,Na2HPO412H2O2.85g,KH2PO40.27g,溶于100ml三蒸水中。用吋稀释10倍。高压灭菌,114°C,15分钟。1.3.4细胞保存液配制:1640培养液80ml,加入小牛血清10ml,再加二甲基亚飒lOmL1.3.5D—HankS液配制:NaCI8g,KCI0.4g,Na2HPO4。12H2O0.06g,KH2P040.06g,NaHCO30.35g,酚红(指示剂)0.02g,依次溶于三蒸水内,加至
6、1000mlo1.4试验方法1.4.1玻璃器械的清洗和灭菌,所用的细胞培养瓶、吸管、离心管等,先用清洁洗液洗净后,干燥箱内烤干,放在重銘酸钾洗液浸泡24h以上,取出,自来水冲洗干净,再用普通蒸憾水冲洗,最后用三蒸水冲洗1・2次。干燥箱内烤干。用布包好,放高压灭菌器内高压灭菌,120°C,30mino取出后放干燥箱内干燥,备用。1.4.2过滤器高压灭菌:过滤器清洗干净、干燥后,装上微孔滤膜(0.22um孔径)’布包好后放高压灭菌器内高压灭菌120°C/30mino1.4.3肝癌细胞(HepG2)培养1.4.3.1复苏:从・86°C冰箱内
7、取出细胞种,迅速放到37°C水浴中化冰(1〜2分钟),取出在无菌培养室操作。在超净工作台中将细胞转到清洁的离心管中,离心1500rpmm5分钟,弃上清,加培养液3ml清洗细胞一次,再离心上清。加培养液2-3ml,用吸管吹打分散细胞后,加到培养瓶内,放入37°C培养箱内培养5%CO2。培养5—7d,长满后进行传代。1.4.3.2加药培养;传代后一瓶原代可得4瓶子代。培养2-3天后,细胞生长良好。每瓶加药20微升;第一瓶加抗癌1号,第二瓶加抗癌2号,第三瓶加三尖衫,第四瓶对照不加药。加药后继续培养4-5天。倒置显微镜下观察细胞,拍片。收集细胞计数
8、(用玻璃计数板。每瓶细胞收集后定容为lml,用培养液稀释5倍,个/ml=四人方格之和×10000×5)o1.5抗癌中药提取。1.5.1抗癌1