1-猪瘟诊断技术

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1、猪瘟诊断技术1范围本标准规定了猪瘟（CSF）临床诊断、病理学诊断及实验室诊断方法的技术要求。实验室诊断方法主要包括：兔体交互免疫试验、免疫酶染色试验、病痔分离与鉴定试验、直接免疫荧光抗体试验、荧光抗体病毒中和试验、猪瘟单抗酶联免疫吸附试验和反转录聚合酶链式反应等诊断技术。木标准适用于猪瘟的诊断。兔体交互免疫试验，免疫酶染色试验，直接免疫荧光抗体试验，反转录聚合酶链式反应和病毒分离与鉴定试验等五种方法主要用于猪瘟病毒和抗原的诊断，以发现带毒猪和自然感染猪；猪瘟单抗酶联免疫吸附试验和荧光抗体病毒中和试验主

2、要用于猪瘟抗体的监测和免疫效果评估，其中，单抗酶联免疫吸附试验主要用于猪瘟抗体的鉴别诊断，可区别诊断猪瘟自然感染猪，免疫猪，强、弱毒抗体阳性猪及猪瘟抗体阴性猪。2临床及病理学诊断2.1临床及病理学诊断的作用感染CSF的猪临床症状和解剖后肉眼所见的病理变化，因病痔株致病力、感染时间和宿主等因不同而有很大差异，同时田间还存在着无临床症状的猪瘟病毒持续性感染和多种病原混合感染的现象，因此，猪瘟的临床诊断和病理学诊断只能作为综合诊断泄性的依据之一,不能作为确诊的根据，特别是那些隐性感染的带毒猪，一般不表现临床

3、症状及肉眼可见的病理变化，所以，猪瘟的确诊应依赖于对CSF病毒及抗原的实验室诊断，才能形成最终的结论。2.2临床诊断猪群中被检猪出现下列临床症状时，可作为综合诊断定性的依据之一：a）体温在40.5°C以上或间歇性的发热；b）精神萎靡、倦怠，畏寒，食欲不振、厌食、甚至废食，呕叶，步态不稳；c）交替便秘与腹泻，产生带粘液和血丝的粪球，结膜充血、出血或有不正常分泌物;d）鼻盘、嘴唇、耳尖、下颌、四肢、腹下及腹股沟等处出现紫红色斑点或斑块；e）公猪包皮积尿或其他疑似CSF的症状；f）怀孕母猪有流产、死胎、木乃

4、伊等现彖或所产仔猪有衰弱、震颤、痉挛、发育不良等现象。出现上述症状时，猪群作为可疑CSF对待，应全群隔离饲养，并作进一步诊断。2.3病理学诊断对临床检出的可疑患猪可抽样进行病理学诊断，下述肉眼nJ见的病变nJ■作为综合诊断的依据之一：a）肾皮质色泽变淡，有不同大小的点状出血；b）淋巴结外观充血、切面周边出血，呈红白相间的“大理石样”；c）脾脏不肿大，表面有点状出血或边缘岀现突起的楔状梗死区；d）心脏、喉头、大肠、小肠、胆囊及膀胱有点状出血；e）全身出血性变化、多呈片状或点状；f）回盲瓣、回肠、结肠形成

5、“钮扣状”溃疡（慢性猪瘟）。3病原学诊断3.1兔体交互免疫试验3.1.1样品处理将病猪的淋巴结、牌脏和肾磨碎后用无热原性的生理盐水作1:10稀释。3.1.2接种家兔将上述处理的样品肌肉注射三只健康家兔，每只5mL,另设三只不注射病料而仅注射生理盐水的对照兔，24h后，每隔6h测体温一次，连续测温5d。3.1.3接种兔毒接种样品5d后对所有家兔注射用无热原性的生理盐水稀释成ImL含有100个兔体最小感染量的猪瘟兔化弱毒（淋巴/脾脏毒），每只1ml,同时增设两只仅注射猪瘟兔化弱毒的对照兔。24h后，每隔6

6、h测体温一次，连续测96h,注射生理盐水和仅注射猪瘟兔化弱毒的两组对照兔分别2/3和2/2出现定型热或轻型热，试验成立。3.1.4判定标准猪瘟强毒不引起家兔体温反应，但能使英产生免疫力，从而能抵抗猪瘟兔化弱毒的攻击。因此，可以利用猪瘟兔化弱毒攻击后是否出现体温反应作指标，以判定第一次接种的病料小是否含有猪瘟病毒。试验组的试验结果判定见表表1兔体交互免疫试验结果判定接种病料后体温反应接种猪瘟兔化弱每后提问体温反应判定结果——含猪瘟强毒、野毒—+不含猪瘟任何病毒+—含猪瘟兔化弱毒+4-含非猪瘟病潭热原性物

7、质对照兔+含猪瘟兔化塚毒注：“+”表示多于或等于三分之二的动物冇体温反应，“一”为无体温反应。3.2免疫酶染色试验3.2.1样品的采集解剖检查时采病猪扁桃体、脾、肾、淋巴结作压印片或冰冻切片，同时设正常组织对照标本，标本自然干燥后，在2%戊二醛和甲醛等量混合液中固定lOmin,干燥后，置冰箱内待检。3.2.2操作程序3.2.2.1将标本浸入0.01%过氧化氢或0.01%叠氮钠的Tris-HCI缓冲液中，室温下作用30min°3・2・2・2用pH7.4的0.02mol/L磷酸缓冲盐水漂洗5次，每次3mi

8、n,风干。3.2.23将标本置于湿盒内，滴加1：10酶标记抗体，覆盖标本面上，置37°C作用45min02.2.2.4用pH7.4的0.02mol/L磷酸缓冲盐水-1%吐温缓冲液漂洗5次，每次2min〜3mimo2.2.2.5将标本放入DAB（4-二甲氨基偶氣苯）Tis-HCI液内，置37°C作用3min。3・2・2・6用pH7.4的0.02mol/L磷酸缓冲盐水冲洗5次，每次2min〜3min,再用无水酒精、二甲苯脱水，封片检查。3・2・2・7用普通生