哺乳动物细胞生产药用蛋白探究进展

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1、哺乳动物细胞生产药用蛋白探究进展利用哺乳动物细胞大规模培养来生产重组蛋白技术已成为生物制药领域最重要的关键技术之一，并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。专家预言：蛋白治疗药物如糖蛋白，抗体和多肽药物仅仅只是开始进入市场，预计在下一个10年或20年会有一个更为快速的发展。蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过目前全世界的生产能力。哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中，开始常用的细胞系有CH0和HEK293两大类细胞。使用较多的C0S细胞,由于其强烈的贴壁作用，曾经限制了大规模悬浮细胞培养生产的

2、实际应用。随着生物技术的发展，CHO细胞可以贴壁培养，也可以经过驯化悬浮培养，是生产包括基因工程抗体药物（人源化或人源抗体）在内的重组糖蛋白的首选工具细胞。HEK293细胞主要用于蛋白瞬时表达及腺病毒生产，尚未见以HEK293表达的药物获得批准。目前，正在进行大规模培养生产的研发中的哺乳动物细胞株还有猿细胞衍生的Veto,Vero细胞是依赖于贴壁培养的细胞，主要用于病毒疫苗的生产；SP2/0和NS0主要用于制备杂交瘤细胞，生产鼠单抗，也有用来生产人源化单抗的报道；以及人的胚胎干细胞等。建立和优化高效的表达载体

3、系统是重组蛋白在哺乳动物细胞生产的关键，是抗体产业化的前提和瓶颈，是提高重组蛋白在单细胞中的表达量的基础。人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含有原核基因序列：大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因等，这样便于载体在原核细胞中扩增和大量制备。另外含有能使外源基因在哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子元件，以及终止子和加polyA信号序列。目前常见的哺乳动物细胞表达系统主要有二氢叶酸还原酶基因扩增系统及GS基因拷贝扩增系统，但是这两种扩增系统所需时间为6〜12个月，蛋白的表达不能在早期得以预测,是此表达系统的限

4、速步骤。造成限速的原因是由于基因的沉默现象产生了特定基因的转录降低或取消。导致基因沉默的主要原因是目的基因所插入位点染色体的结构。异染色质区DNA较浓缩，转录不活跃，而常染色区较松驰，转录活跃。国外最近一直在发展一次性表达的技术，以此来达到提速和优化的目的，方式一是通过在转录水平及翻译水平的修饰改构，如MARS、STARS和UC0S等序列的添加；方式二是通过筛选标记基因的弱化来提高表达量；方式三是通过定点整合的方式来提高表达量。在哺乳动物细胞大规模培养的工业化生产过程中，主要目的是提高产物的产量和质量。绝大数

5、是在生物反应器中进行的哺乳动物单细胞培养都是悬浮式培养，具体来讲就是要提高细胞密度和产物浓度，降低培养基成本与过程运行成本，同时满足产品质量要求和安全性要求。当前动物细胞大规模培养研究主要集中在技术优化方面，包括发展高通量细胞克隆技术筛选高表达细胞株，进行细胞驯化改变细胞的生长方式及生长环境，针对特定细胞的营养需求进行培养基优化，针对特定细胞与产品的过程优化等，这些都是提高细胞密度与产物浓度的有力途径。以培养基是否添加血清成分，可以分为血清培养基和无血清培养基。血清的成分和作用复杂，同时存在价格昂贵、血清成分

6、不明确、批间差异大、存在潜在污染等缺点，使培养过程具有不可控制性，同时血清的使用也给蛋白纯化带来困难。因此，尽管血清培养基适用于大多数细胞的培养，血清培养及动物来源成分培养已经逐渐被FDA等药物管理部门限制。无血清培养始于二十世纪六、七十年代，现已有各种商业化无血清培养基或针对特定细胞的工业用无血清培养基用于细胞的大规模培养。成分明确、无动物来源成分或无蛋白培养基用于工业生产可以有效降低培养及下游纯化成本、提高过程稳定性、同时避免了外源生物污染，更容易被FDA等药物监管部门批准。而化学成分明确的培养基更易于对

7、细胞的营养需求进行研究，使得过程优化工作更加容易进行。因此无血清无动物来源成分或无蛋白培养基是大规模动物细胞培养的主要原料取向。细胞驯化的实质是对细胞进行条件筛选的过程，其目的是通过改变细胞的生长方式和生活环境以适应特定的工业化需要。根据不同需要可以对工程细胞进行各种驯化：如贴壁的CHO细胞有悬浮生长的倾向，可以进行由贴壁生长到悬浮生长的驯化，血清培养的细胞经过驯化可以无血清无蛋白培养，经过驯化工程细胞可以提高对NH4+等有毒代谢物的耐受力，延长培养维持时间，提高产物浓度。动物细胞培养的流加工艺从二十世纪九十

8、年代开始，日趋成熟，其目的是为了避免培养过程中的营养限制和有毒副产品积累，使细胞生长的营养和理化环境尽可能长地保持稳定，提高细胞密度和维持时间，从而提高产物浓度。目前世界上大约有60%以上的重组蛋白质药物的生产采用哺乳动物细胞培养技术。哺乳动物细胞制备的蛋白质药物质量高，它们与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物学功能。随着对基因组学、蛋白质组学和代谢组学不断深入研究,人们对哺乳动物宿主细胞的生理、生