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1、五味子特殊类型白果五味子ITS2序列鉴定探究［摘要］目的：以ITS2片段作为DNA条形码，在分子水平上研究白果五味子。方法：结合五味子和华中五味子样品对白果五味子进行研究，对样品ITS2片段进行双向测序，CodonCodeAligner拼接序列，利用MEGA5.0进行多序列比对，利用ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构，应用BLAST1方法进行鉴定分析。结果：白果五味子样品ITS2序列长度为231bp,BLAST1鉴定白果五味子样品为五味子。白果五味子和五味子居群间平均K2P(Kimura-2-parameter)遗传距离(0.0022)远远小于五味子和华中五味子的种间平均K2P遗传
2、距离(0.0216)o结论：ITS2鉴定白果五味子属于五味子；ITS2可以用于鉴定和区分五味子和华中五味子。［关键词］五味子；ITS2；居群；DNA条形码［收稿日期］2013-11-15［基金项目］国家科技基础性工作专项重点项目(2007FY1106002010)；辽宁省教育厅项目(LT2010067)［通信作者］王冰，教授，博士生导师，主要从事药用植物种质资源与质量研究,Tel:15998530566,E-mail：wangbingl616@163.com［作者简介］李先宽，博士研究生，主要从事药用植物种质资源与质量研究，Tel:13591727569,E-mail:lixiankuan
3、l68@163.com五味子为木兰科多年生落叶木质藤本植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill的干燥成熟果实［1］,是历代药典收载的常用药材。作为一种传统中药，常用于治疗干咳，哮喘，盗汗，遗精和慢性腹泻等［2-3］o五味子是辽宁省最重要的道地药材，由于近些年五味子的广泛种植，其广泛的种源，即种质资源来源不一致是影响五味子质量的一个重要因素［4］。从2008年开始，本课题组一直追踪观察辽宁省栽培五味子所结果实为白果的一种特殊类型一一白果五味子［5］,其药材质量的优劣是一个需要认真研究的问题。ITS2片段具有适合扩增和测序的长度，在物种水平的变异较快，有更多的
4、突变位点以区分不同的物种，因此，在DNA条形码鉴定物种方面具有潜在的研究价值。本研究利用核基因ITS2片段作为DNA条形码［6-10］,结合五味子和华中五味子，在分子水平上对白果五味子基原植物进行研究，探索白果五味子和五味子的亲缘关系，提供白果五味子DNA分子水平的鉴定资料，为明确辽宁省道地药材五味子种质资源的遗传多样性以及合理保护和利用五味子种质资源提供理论依据。1材料与方法1.1材料供试样品（植物叶片）于2012年6-9月采集，包括3个栽培居群和3个野生居群，共计53份样品，包括五味子和华中五味子2个物种。样品经硅胶迅速干燥后,置于-86£超低温冰箱保存备用。白果五味子有针对性的取8个
5、样株，在同一农场内随机取正常的五味子5个样株，其他样品均为随机取样，样品信息见表lo样品经辽宁中医药大学药学院王冰教授鉴定为五味子S.chinensis和华中五味子S.sphenantheraRehd.etW订s.,凭证标本保存于辽宁中医药大学药用植物实验室。1.2仪器和试剂台式冷冻离心机（Fresco）、数显恒温水浴锅（HH-S型，巩义市予华仪器有限责任公司）、PCR仪（MG96G型，杭州朗基科学仪器有限公司）、电泳仪（EPS-600型，上海天能科技有限公司）、凝胶图像处理系统（Tanon-4100,上海天能科技有限公司）、植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，TIANGEN）TaqMa
6、sterMix（康为世纪）、引物（上海Sangon公司）、5kDNAMarker（北京全式金生物技术有限公司）、琼脂糖、EB（上海Sangon公司），ABI3730XL测序仪，其余试剂均为分析纯。1.3DNA的提取选取硅胶干燥的植物叶片约20mg,用液氮研磨粉碎，使用试剂盒提取总DNA,具体步骤参照植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，TIANGEN）的操作。1.4PCR扩增及产物测序扩增ITS2序列正向引物5'-GCGATACTTGGTGTGAAT-3r,反向引物5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-37。PCR反应体积50uL,引物各1.0uL(2.5umol•L-l)(S
7、angonCo.,中国),25uLTaqMasterMix,总DNA1yL(约20ng),加RNase-Free水补足50uL。引物及扩增程序参照Chen等［6］的研究方法。PCR扩增产物经纯化后，使用ABI3730XL测序仪(AppliedBiosystemsCo.,USA)进行双向测序。1.5数据处理测序后所得序列采用CodonCodeAlignerV3.0.1(CodonCodeCo.,USA)校对拼接，去除低质量
