资源描述：
《关于染色质免疫共沉淀chip实验原理及实验总结》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、关于染色质免疫共沉淀Chip实验原理及实验总结ChIP实验原理在活细胞状态下固定蛋白质一DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集冃的蛋白结合的DNA片段，通过对冃的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。可以利用ChIP研究转录因子（transcriptionfactor,TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互
2、结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋口与蛋口，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TFPromoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在-•起，这个吋候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。一•般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋口的抗体，与靶蛋A-DNA复合物相互结合——加入ProteinA,结合抗体■靶蛋A-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下來的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋A-DNA复合物——斛•交联，纯化富集的
3、DNA■片断——PCR分析。ChIP实验步骤第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。1、取出1平1111细胞（10cm平皿），加入243U137%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%。（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育lOmino3、终止交联：加LT氨酸至终浓度为0.125Mo450ul2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml,3ml和3ml）。预冷后2000rpm5min收集细胞。6、倒去上清。按照细胞量，加入SDSLysi
4、sBuffer。使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。这样每100ul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4“06个细胞。因此每管加入400ulSDSLysisBuffer。将2管混在一起，共800ulo7、超声破碎：VCX750,25%功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。（二）、除杂及抗体哺育。8、超声破碎结束后，10,000g4度离心lOmino去除不溶物质。留収300ul做实验，英余保
5、存于一80度。300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M）,65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50xPIC。再各加入60ulProteinAAgarosc/SalmonSpennDNA。4度颠转混匀lh。10>lh后，在4度静置lOmin沉淀，700rpm离心1min。11、取上清。各留取20ul做为inputo一管中加入lul抗体，另一管中则不
6、加抗体°4度颠转过夜。（三）、检验超声破碎的效果。取100ul超声破碎后产物,加入4ul5MNaCl,65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。第二天：（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。12>孵育过夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4度颠转2h。13、4度静HlOmin后，700rpm离心1min。除去上清。14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转lOmin,4度静置lOmin沉淀，700rpm离心lmin,除去上清。洗涤溶液：a.lowsal
7、twashbuffer——onewashb.highsaltwashbufferonewashc.LiCIwashbufferonewashd.TEbuffertwowash15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方:100ull0%SDS,100ullMNaHCO3,SOOulddH20,共1ml。每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后，收集上清。重复洗涤-•次。最终的洗脱液为每管500ulo16、解交联：每管屮加入20ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65度解交联过夜。笫三天：（一）、DNA样
8、品的回收17、解交联结束后,每管加入lulRNaseA（MBI）,37度孵育lh。18、每管加入10ul0.5MEDTA,20ullMTris.HCl（PH6.5）
