药靶或协同药靶及药物机理的研究思路之一

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1、药靶或协同药靶及药物机理的硏究思路之一药靶或协同药靶及药物机理的硏究思路之一By季博今天跟大家分享的nature是关于药物和靶点的。药物是Lenalidomide,治疗的疾病是由于染色体5q缺失(del(5q))导致的骨髓增生异常综合症(myelodysplasticsyndrome,MDS)。(naturel4610.pdf,LenalidomideinducesubiquitinationanddegradationofCKlaindel(5q)MDSo全文上传qq群188462716)这个疾病季博不了解。这篇文章做的是药物Lenalidomide作用的机理。解释药物

2、为什么有效。几个背景.Lenalidomide可结合CRBN(也就是直接药靶，直接结合)zCRBN为CRL4泛素连接酶的adaptor。药物结合后，可加速IKZF1和IKZF3的降解。加速T细胞释放IL2。Lenalidomide可加速del(5q)的MDS细胞凋亡。作者就想看看Lenalidomide是导致什么东西降解从而使得del(5q)的MDS细胞凋亡。解释药物作用的机理。其实这个非常重要，科硏中，机制是做得越清晰越好。在药物开发中也是一样。药物作用的机理越清晰越好。如果出现副作用,或耐药，知道机理，就可以进行修补。呵呵。—、Lenalidomideinducesd

3、egradationofCKla开始找差异蛋白了。大家看思路。细胞模型，为del(5q)的骨髓细胞系KG-le在加药和不加药的情况下,做SILAC-MS。寻找加药后，出现差异的蛋白。(因为涉及到泛素的修饰，所以，这里一定要采用质谱来检测差异蛋白。)发现CRBN的泛素化水平下降JKZF1泛素化水平上升。与以往的硏究一致。(大家注意，这个就是季博以前说的,别人的结论需要在自己的研究中做下验证,以证明自己的体系是可以重复出前人的结果的。证明体系没有问题。)在此基础上，新发现CKla泛素化水平上升。CKla是走位在del(5q)的缺失区域的。CKla在前人的研究中认为可以作为骨髓

4、瘤的药靶。二、CKlaisasubstrateofCRL4CKla有改变，那么是否为直接的泛素化底物呢。在多个细胞内加入药物,检测CKla,发现蛋白水平下降。mRNA不变。这个改变可以被蛋白酶抑制剂MG132所抑制。也可被泛素连接酶的抑制剂MLN4924所抑制。说明Lenalidomide对CKla的调控是通过泛素化和蛋白降解。文章高大上的一步，采用cas9技术把CRBN敲除，发现Lenalidomide对CKla的降解调控消失了。说明Lenalidomide对CKla的降解调控需要CRBN。其实很好理解，因为Lenalidomide可结合CRBN,而CRBN是泛素连接酶

5、的adaptor。文章中是采用新技术，再次验证了这个结论。然后做了下zCKla与CRBN间是否为直接互作。发现只有在Lenalidomide存在的情况下,CKla可以与CRBN直接结合。且做了区段分析，发现CKla的1-177氨基酸是负责其接受Lenalidomide泛素化调控的关键位点。这里的区段分析，跟平时的不一样。采用了同源蛋白分析的方法,很巧妙的方法。不过要注意，成功了是0K的。不成功，重新想办法，呵呵。三、EffectofCSNKlAlexpressionlevelCKla由基因CSNK1A1编码。下面就开始对CKla进行功能实验了。CKla在其他研究中已经证明

6、可以抑制p53的活性，跟凋亡相关。文章中就采用慢病毒介导的shRNA，把CSNK1A1干扰后，检测凋亡。发现，干扰后，抑制增殖或存活。加入Lenalidomide后,CSNK1A1干扰的细胞更加敏感。Tips这里说明CSNK1A1是Lenalidomide的增敏药靶，呵呵。这个增敏药靶是直接药靶的下游(做药靶或协同药靶硏究的记住这点，呵呵。当耐药发生时,可以往直接药靶下游找找协同药靶)O有了这个结论。开始做过表达实验了。相当于rescue实验。拿的是病人的细胞，在CSNK1A1缺失的细胞中，过表达CSNK1A1z看对Lenalidomide的敏感性。发现过表达CSNK1A

7、1可降低细胞对Lenalidomide的敏感性。很棒的数据。不过大家注意,del(5q)细胞少CSNK1A1,对药物敏感。过表达CSNK1A1后，敏感度下降。但是，在正常细胞中过表达CSNK1A1,看不到这个效应。呵呵。这就是季博讲座中说的,过表达，很可能会有假阴性。因为细胞内已经有很多了，再加进来，可能看不到效果。四、Species-specificeffectsoflenalidomide这篇文章真的是需要好好学习。作者发现lenalidomide在小鼠细胞中无效。联想到lenalidomide的直接结合靶点是CBRN，就