孕早期绒毛和蜕膜组织差异表达蛋白的初步研究

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1、孕早期绒毛和蜕膜组织差异表达蛋白的初步研究李红梅，龙玲，邓丽，姚春莉(第三军医大学西南医院妇产科，重庆400038）摘要：目的：利用蛋白质组相关技术分析孕早期胚胎绒毛（villus）和蜕膜（deciduas）组织蛋白质组的差异表达，探讨胚胎植入的可能机制。方法：用固相pH梯度双向凝胶电泳(2D-PAGE)分别分离正常早孕人工流产者的胚胎绒毛和蜕膜的蛋白质组。考马斯亮蓝显色，PDQuest2DE软件分析。结果：图像分析测得绒毛与蜕膜凝胶的匹配率蜕膜达45％，在等电点pI4~7、分子量14.40~116.00kD范围内，分离得到正常早孕绒毛蛋白点大约680个，蜕膜蛋白点大约621个，其中至少

2、33个蛋白点在绒毛中的表达量高于蜕膜3倍以上，27个蛋白点在蜕膜中的表达量高于绒毛3倍以上。结论：早期胚胎绒毛和蜕膜蛋白质的差异表达，可能是胚胎植入的一个原因。关键词：蛋白质组；绒毛；蜕膜胚胎植入涉及两个关键事件：一是胚胎对子宫内膜腔上皮的黏附，二是子宫内膜基质的蜕膜化。在植入窗口期，胚胎滋养层细胞达到侵入状态，宫内膜达到接受状态，两者同步发生才导致胚胎成功植入。本课题利用蛋白质组的相关技术分析了孕早期胚胎绒毛和蜕膜组织蛋白质组表达的差异，这有助于从蛋白质组整体水平上探索胚胎植入的可能机制。作者：李红梅（1982~），主要研究方向：胚胎着床相关机制1材料和方法1.1实验材料选择2007年

3、1月～2007年5月在本院行人工流产者的胚胎绒毛和子宫蜕膜组织各25例（妊娠第10周正常妊娠，标本收集均征得病人知情同意。选择无遗传病史、无产道异常、无免疫系统异常等情况下自愿终止妊娠的标本）。1.2试剂胰酶（Promega）、DMEM（Sigma）、DnaseI（Sigma）、Percoll（Sigma）、FBS（Hyclone）、低分子量蛋白标记物、Pharmalyte（pH3~10）购自AmershamPharmaciaBiotech，30%丙烯酰胺（29∶1，3.3%C）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、二硫苏糖醇（DTT）、硫脲（Thioourea）、十二烷基硫酸纳（SDS）、I

4、PG干胶条（pH3~10,11cm）、甘氨酸（glycin）购自Bio-Rad，超纯脲（ultraurea）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙基硫酸盐（CHAPS）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、碘乙酰胺（iodoacetamide）、考马斯亮蓝R-250、G-250购自Sigma，Trypsin购自Promega,其余试剂均为国产分析纯。1.3设备IPGphor、附件和循环水浴(AmershamPharmacia)、ProteinⅡXLCell电泳仪、PDQuest8.0（Bio-Rad）、MALDI-TOF-MS（ABI）、NikonD100+AF-SNIKKOR17-35mm1:2.8D

5、数码相机。1.4实验方法1.4.1蜕膜和绒毛组织的获取将人工流产标本置于装有生理盐水的消毒器皿中，用4℃生理盐水反复洗涤标本后，仔细分离绒毛枝和蜕膜组织，再将分离的绒毛枝和蜕膜组织分别置于不同的消毒皿中，并用4℃生理盐水冲洗标本组织10次（冲洗工具分别使用，互补混用），然后置于4℃冰箱备用。1.4.2蛋白样品的制备取绒毛和蜕膜组织，按50mg标本加lml裂解缓冲液（7mol/Lultraurea、2mol/LThiourea、4％CHAPS、65mmol/LDTT、40mmol/LTris、0.2％pH3~10的Pharmalyte、0.1g/LPMSF），经液氮反复冻融、研磨3次后加入

6、0.02g/LDnase和5mg/LRnase，4℃放置15min，12000r/min，4℃离心30min。取上清分装，-80℃保存，Bradford法测定上清液中蛋白浓度。1.4.3二维凝胶电泳将提取的绒毛或蜕膜组织蛋白样品500µg加入重泡胀液中，使总体积为200µl，用等电聚焦仪，按如下程序自动进行：①14h重泡涨；②250V，0.5h；③1000V，0.5h；④8000V，4h，聚焦至40000Vh（伏小时）。等电聚焦结束后，将IPG胶条分别放入5ml平衡液Ⅰ（2%DTT）和5ml平衡液Ⅱ（含2.5％碘乙酰胺）中，各平衡15min，然后进行第二向垂直平板SDS-聚丙烯酰胺凝胶电

7、泳。1.4.4染色及图像分析考马斯亮蓝R-250染色2h，脱色过夜。染色后的凝胶用NikonD100+AF-SNIKKOR17~35mm1:2.8D数码相机进行拍摄，用PDQuest8．0软件进行图像分析，以绒毛组为参考胶，将蜕膜组与之相比较，选取3倍以上的差异点作为目的蛋白进行质谱分析。1.4.5差异表达蛋白MALDI-TOF质谱分析1.4.5.1蛋白斑点PMF样本的制备沿染色区边缘切下目的蛋白质点，用50%ACN/25mmol/