慢病毒介导shrna沉默e2-2基因对内皮前体细胞生长与增殖的影响

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1、慢病毒介导shRNA沉默E2-2基因对内皮前体细胞生长与增殖的影响刘晓丽、马阳、梁源、杨海捷、梁云华、王红(成都军区昆明总医院干部病房，昆明650032)[摘要]目的构建小鼠转录因子基因E2-2RNAi慢病毒载体,并观测其沉默E2-2基因对内皮前体细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）生长与增殖的影响。方法首先分离、培养小鼠骨髓EPCs，并予以鉴定。针对E2-2基因mRNA序列，筛选3个潜在的siRNA干扰靶点并予以合成；将合成的siRNA导入EPCs，用RT-PCR法检测其抑制效果，以确定最佳siRN

2、A。设计并合成针对最佳siRNA靶序列的shRNA，连入FT203-PLVX载体，构建慢病毒载体FT203-PLVX/E2-2shRNA，并予以测序鉴定。测序正确者经293细胞包装，形成具高效感染力的E2-2shRNA慢病毒。将该重组慢病毒感染EPCs，倒置显微镜观测被感染细胞的绿色荧光蛋白（GFP）的表达变化、CCK-8（cellcountkit-8)法检测被感染细胞的生长与增殖；在mRNA和蛋白水平分别检测并定量分析被感染细胞的E2-2及核抗原PCNA基因及其编码蛋白的表达情况。结果小鼠骨髓EPCs得以分离、培养并予以鉴定。筛选到

3、E2-2基因的最佳干扰靶序列为CGTCAGCTAGTGTTTCTAA；测序证实，成功构建FT203-PLVX/E2-2shRNA慢病毒载体。荧光观察显示，被感染细胞显著表达GFP。CCK-8检测表明，与对照细胞比较，沉默E2-2的EPCs的生长与增殖加快，48h开始变得更为明显（P<0.01）；mRNA和蛋白水平检测及定量分析证实，E2-2shRNA慢病毒能有效沉默EPCs的E2-2，并上调其核抗原PCNA基因及其编码蛋白的表达。结论小鼠骨髓EPCs得以分离、培养并予以鉴定。成功构建E2-2基因RNAi慢病毒载体，该载体能有效沉默EP

4、Cs的E2-2基因，促使EPCs的生长与增殖并上调其核抗原PCNA的表达。[关键词]E2-2基因；RNA干扰；内皮前体细胞；慢病毒载体[中图分类号][文献标志码]TheeffectofE2-2genesilencingbylentvirus-mediatedshRNAonthegrowthandproliferationofendothelialprogenitorcellsLIUXiao-li,MAYang,GAOYuan,YANGHai-jie,LIANGYun-hua,WangHong(Cadres’Wards,KunmingG

5、eneralHospitalofchengduMilitaryCommand，Kunming,Yunnanprovince,650032,China)[Abstract]ObjectiveToconstructaRNAinterference(RNAi)lentiviralvectortargetingmurinetranscriptionfactorE2-2geneandinvestigateitseffectongrowthandproliferationofendothelialprogenitorcells(EPCs).Met

6、hodsMurineEPCsofbonemarrowwereisolated,culturedandidentified.ThreepotentialRNAisiteswerescreenedbasedonthemRNAsequenceofE2-2geneandsynthesized.ToidentifytheoptimalsiRNAsequencebyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR),thesethreesynthesizedsiRNAweretransfecte

7、dintoEPCs.ThentheshorthairRNA(shRNA)oligonucleotidetargetingtheoptimalsiRNAsequencewasdesigned,synthesizedandinsertedintoFT203-PLVXplasmidtoformFT203-PLVX/E2-2shRNAlentiviralvector.Afteridentifiedbysequencing,FT203-PLVX/E2-2shRNAplasmidwastransfectedinto293cellstoproduc

8、elentiviralparticles.ThelentiviralparticlesweretransfectedintoEPCsandtheexpressionofgreenfluorescentprotein(GF