核酸酶催化放大传感体系的设计及其在铅离子比色检测中的应用

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1、核酸酶催化放大传感体系的设计及其在铅离子比色检测中的应用摘要：基于817DNA酶的催化切割特性和类辣根过氧化物酶DNA酶的氧化还原反应催化特性，发展了一种新型核酸酶催化放大传感体系，并用于Pb2+的比色检测。考察了K+浓度，pH值及反应时间对检测体系的影响。ABTS吸光度变化与Pb2+浓度在5.0〜100nmolL范围内呈良好的线性关系，检出限为3.0nmolLo此外，因Pb2+酶的特异性，本方法对Pb2+具有良好的选择性。关键词：DNA酶；比色检测；催化放大;生物传感;铅离子j1引言当前，重金属污染仍然是一个全球性问题，特别是在发展中国家，已对人体健康造成

2、了重大伤害［1］。我国规定:饮用水中Pb2+含量不得高于50_SymbolmA@_gLo目前，Pb2+的检测方法主要有双硫腺比色法、原子荧光法［2］、原子吸收光谱法［3］、气相色谱法、离子交换色谱法、阳极溶出伏安法、微分电位溶出法和极谱法等仪器分析方法［4］。这些方法一般操作复杂、仪器价格较高、且灵敏度有待提高。近年来，许多研究者致力于发展Pb2+检测新方法，如基于生物分子及纳米材料的生物传感方法等［5］。然而这些方法或多或少的存在一些缺陷，使之广泛应用受到了限制。核酸、核酸酶探针易于合成，性质稳定，使用方便，已得到广泛的研究和应用［6］。对于核酸探针，具有

3、代表性的如核酸适配体（Aptamer）［7］,发夹结构的分子信标［8］,以及其它基于DNA构象变化的DNA生物探针［9］。核酸酶是通过体外选择（Invitroselection）得到的一类新型功能核酸［10］。不同的DNA酶可以催化不同的化学反应，包括DNA或RNA的切割连接反应、磷酸化、氨基磷酸酯键的切割等。与蛋白酶相比，DNA酶具有高稳定性，在生物化学和药物领域具有广阔的应用前景。许多DNA酶催化活性需要依赖于特定金属离子的辅助，从而为应用于特定金属离子的检测提供了可能。利用这种特性的生物传感检测已有报道［11〜13］。此外，另一种让人感兴趣的DNA酶是

4、由G四股螺旋超分子结构结合血红素（Hemin）而成［14］。它具有过氧化物酶的催化活性，能够催化氧化双氧水介导的底物体系，如鲁米诺，ABTS（2,2联氮二（3乙基苯并喙哩6磺酸））和TMB（3,3’，5,5’四甲基联苯二胺）。表现出化学发光、紫外吸收以及颜色改变等信号的变化，具有优越的分析应用意义［15］o本研究将具有不同功能特性的核酸序列组合到一起，发展了一种核酸酶催化放大比色传感平台，并用于Pb2+的比色检测。实验原理如图1所示，将富G核酸序列封闭于发夹结构探针中，当存在Pb2+时，发夹结构探针被切断，释放富G核酸序列，与Hemin结合形成DNA酶，引发

5、显色反应。通过吸收信号的响应即可达到检测Pb2+的目的。其中探针部分包含17E的底物链序列和构成催化DNA酶的富G序列。探针被设计为发夹结构，以实现对Pb2+的特异性显色。显色体系中所用的Pb2+DNA酶序列为经典的“817”脱氧核酶结构[11],在Pb2+存在下显示出很高的催化切割活性。底物链是一个DNA与RNA嵌合体，剪切位点有一个腺嚓岭核酸核昔(rA),其余碱基全部为脱氧核糖核昔酸。当不存在Pb2+时，也就是DNA酶不切割的情况下，探针的，Loopstem，发夹结构非常稳定，富G序列由于杂交配对被封闭，所以不能形成G四链体Hemin复合结构，即不能催化

6、底物发生氧化还原显色反应。当存在Pb2+时，DNA酶切断了发夹结构探针的Loop部分，Loopstem发夹结构被破坏，只有几个碱基配对的双链茎部不能稳定存在，因此释放出富G序列与Hemin结合，形成具有很强过氧化物酶活性的DNA酶,催化ABTSH202发生显色反应，反应液的紫外吸收值的变化与Pb2+的浓度相关(图2)o从图2c可见，当不加入Pb2+时，体系仍有很高的吸收，说明17E会与发夹探针的Loop部分杂交，导致探针的Loopstem发夹结构不稳定或被破坏[16],从而释放出富G序列与Hemin结合，形成G四链体复合结构，催化底物进行显色反应，增加检测体

7、系的背景信号。所以，本实验加入Antil7E互补结合17E,以降低检测体系的背景信号。3.2.2溶液pH值的影响在形成G四链体过程中，层间的G碱基之间是通过氢键的作用连接在一起的。由于pH值影响氢键形成，实验中考察了溶液pH值对检测体系的影响。如图4所示，在溶液pH为6.0〜7.0时，体系的紫外吸收变化不大。当溶液pH>7后，随着pH值升高，体系的信号响应逐渐降低。当pH=8.0时，本体系的紫外吸收变化几乎为零。所以在本实验体系中，溶液酸度选择为pH=7.0o3.2.3酶切速率的考察在Pb2+存在下，底物被催化切割的速率加快[13],从而释放出富G序列，形成

8、G四链体结构。从图5可见，当反应时间达到30min后