酵母表达系统概述及相关研究进展

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1、酵母表达系统的研究进展和前景（XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院）摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面己经得到广泛而成功的应用，表达出的重组蛋白表现岀较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。近年來，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体収得了新的进展。本文主要从上游设计，重组表达，分离纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对未来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。关键词：酵母表达系统；蛋口分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物引言酵母作为一种表达外源基因的宿主菌，既具有操作简单，生长快等特点，又具有真核细

2、胞的翻译后修饰加工系统。在表达某些基因工程产品时，可以大规模生产，从而有效地降低成本。常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统，甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。酿酒酵母（Saccharomyces.cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。但由于酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophicyeast）为代表的笫二代酵母表达系统。其屮毕赤酵母（P.pcistoNs）是继S.cerevisiae之后被迅速推广的一种外源基因表达的宿主菌。酿酒酵母难于高密度培养，分泌效

3、率低，几乎不分泌分子量大于30kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。但是，可以通过基因敲除或改造用酿酒酵母表达亚单位疫苗（如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等）或非蛋白活性物质及其中间体（如青蒿素，色素）。与原核和其它真核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母作为重组蛋白表达系统有以下优点111：（1）生长速率快，易于高密度培养（2）在几乎不含蛋白质的培养基中具有高水平产率（3）消除了内源毒性和噬菌体感染（4）易于对具有明确特征的酵母表达载体进行操作（5）对毕赤酵母的噬菌体对人没有病原性（6）具有

4、多种翻译后修饰包括多肽折叠，糖基化，乙酰化，甲基化，蛋白质降解调控以及定位至亚细胞结构（7）能够构建分泌的蛋白，这样只需从生长培养基小提纯而不必收集酵母木身细胞。基因工程与酵母表达系统即使酵母表达系统具有一些优势，但在用于生产蛋白质等药物时，还需要选择合适的载体并对宿主菌的某些代谢途径进行改造，使之利于目标产物的表达，要用于工业生产，还需根据实际情况优化培养条件，比如pH,温度，溶氧量，培养基营养，特殊添加剂等。酿酒酵母的表达载体有自主复制型和整合型，自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序?lj(automaticrcplicatingsequence,AR

5、S),能够独立丁酵母染色体外进彳亍复制，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS,必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。为此，人们设计了pMIRY2(formultipleintegrationintoribosomalDNinyeast)质粒，旨任将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组屮串联存在的150个重复序列)，因此利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝。值得注意的是，酿酒酵母表达的外源蛋白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40个以上的甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅1,3甘

6、露糖，致使产物的抗原性明显增强。毕赤酵母的表达载体多采用整合型载体，即将异源基因通过载体整合进酵母基因组中，这是由于没有适合毕赤酵母的游离型表达载体。所有巴斯德氏毕赤酵母的表达载体都是一个表达组件，它由一个启动子序列(大多是AOX1启动子)，一个來自AOX2的转录终止序列用以指导3,终止过程和mRNA的多聚腺背酸化，在它们之间有一个或多个克隆位点用以插入外源基因。这样的设计保证了产物(cap・AOX/5，UTR-ORF-3rUTR-polyA)是一个成熟的mRNA以适应毕赤酵母的细胞体系，确保了信息的稳定性和有效性。检测表达所用的标记基因一般是HIS4(组氨醇脱氢酶基因)，

7、有时也用畑」(卡那霉素抗性基因)或Sbb/e.此外，有时为了防止酵母口身蛋白酶对所耍表达的异源蛋白的降解，会使用蛋白酶缺陷突变型或降低发酵温度，保证目的蛋白的产量和得率。发酵过程一般分两个阶段，第一阶段是细胞以甘油为碳源生长，廿油耗尽后进入第二阶段，加入甲醇诱导AOX1启动子的转录翻译，从而使异源基因表达，生产目标蛋白。酵母表达系统研究进展1.利用酿酒酵母生产青蒿素前体一一青蒿酸青蒿素(Artemisinin)是目前治疗疟疾的高效药物，这主要是由于疟原虫(Plasmodiumfalciparum)逐渐对其它药物产生