王大亨酶工程报告3

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1、酶工程第三次报告生物技术091王大亨2009016255一、蛋白质分离纯化的一般程序1.1酶原材料的选择在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋口酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实屮捉取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法來获得大量的酶制剂。1.2材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。1.3蛋白质的抽捉通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离

2、了强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋片质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液屮一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋口质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。1.4蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来，比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。1.5样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。二、SOD的提取分离及纯化所采用的技术方法2」磷酸缓冲液提取法SOD极性较大，易溶于水，根据相

3、似相溶原理，可用水来浸取提取材料但磷»缓冲液可提高浸取效能，增加制品的稳定性，减少杂质，因此实际操作中常采用的磷酸缓冲液代替水來浸取SOD提取材料，得到粗提取液但该方法的缺点是浸出范围广，选择性相对差，容易浸出大量的无效成分，且会引起一些冇效成分的水解。2.2超声波破碎法超声波破碎法是一种辅助浸取技超声波的空化作用产生极大的压力造成被粉碎物细胞壁或整个细胞的破碎，而冃整个破碎过程在瞬间完成超声波产生的振动作用增加了溶剂的湍流强度及相接触面积，加快了细胞内物质的释放扩散及溶解，从而强化了传质，冇利于细胞内冇效成分的提取。2.3热变性法热变性法是依据的热稳定性原理设计的的热稳定性高，当温度低于时，

4、短时间的热处理不会使酶活力有明显的变化，而一般的杂蛋白却在温度高于时就易变性沉淀，因此，对SOD粗提液进行短时间的热处理可以达到去除朵蛋白的目的热变性法作为一种初步的纯化手段，操作简便，经济实惠，是工业上常用的分离的方法。2.4有机溶剂分级沉淀法2.4.1丙酮沉淀法利用向蛋白质溶液中加入弱极性的有机溶剂，改变溶液的介电常数，使不同种类蛋白质的溶解度产生不同程度降低的原理可进行蛋白质的纯化。在粗酶液屮逐量加入内酮，可使及其他杂蛋白的溶解度发牛变化，依次从溶液屮沉淀出来。内酮加入量达到1.0V/V时，比活最高，再加入内酮将导致酶活力急剧下降，因此当以去除杂蛋白为目的时，丙酮的加入量不宜超过1.0V

5、/V。2.4.2氯仿■乙醇沉淀法氯仿•乙醇混合液可作为萃取剂将SOD溶解于其中，并将杂蛋白沉淀出来另外，SOD对氯仿乙醇的作用不敏感，处理12h后，活性没有明显的变化，因此用该法粗分离SOD是可行的・・2.5硫酸钱分级盐析法盐析法是利用在高浓度的电解质溶液内，蛋白质分子表面的水化层被破坏，使蛋白质分子中的憎水区域裸露而导致蛋白质分子聚集沉淀的原理进行分离的。硫酸鞍因价廉溶解度大，H能使蛋白质的性质保持稳定而成为最常用的盐析剂。硫酸镀分级盐析法的优点是方便易行，常温下也不易导致酶失活，纯化效果好，与冇机溶剂分级沉淀法相比更冇利丁•保持蛋白质的生理活性，但分辨率不及有机溶剂分级沉淀法2.6透析透析

6、是利用蛋白质分子不能通过半透膜，而使蛋白质和其他小分子物质分开的方法透析通常不作为纯化酶的一种单元操作，但通过透析可除去酶液中的盐类有机溶剂低分子量抑制剂等，所以它在纯化过程中极为常用・。透析膜的截留极限一般在分子量5000左右，而SOD的分子量远高于此，因此适合于透析法。2.7膜分离技术膜分离技术采用了能选择地透过一种物质，而阻碍另一种物质透过的具有特定性质的半透膜，它的实质是利用物质经过膜的传递速度不同而使其得以分离。三、酶活性的测定3.1活性的测定测定询在54ml14.5mmol/Ldl-甲硫氨酸中分别加入EDTA,NBT,核黄索溶液各2ml混匀，此为反应混合液。在盛有3ml反应混合液的

7、试管中，加入适量的酶液（以使抑制达50%左右的酶浓度为佳），混匀后放在透明的试管架上，于光照培养箱屮准确照光30分钟，迅速测定560nm卜•的光密度，以不加酶液的照光管为对照，计算反应被抑制的方分比。或者按照表1加入试剂量进行添加。表1试剂样管最大光化管对照管/mldl-甲硫氨酸2.72.72.7EDTA0.10.10.1核黄索0.10.10.1NBT0.10.10.1酶液适量——3.2活力的计算