《分子生物学实验》课程教学大纲

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1、《分子生物学实验》课程教学大纲课程编号：05030适用专业：生物工程与生物技术实验学时数：36学时实验学分：1教材：主要参考书：《分子生物学实验指导》徐庆华等成栋学院立项教材2009一、课程说明《分子生物学实验》以介绍分子生物学中的实验方法、实验手段和培养学生实验操作技能为其主要内容。需要以分子生物学基本理论为基础，其教学目的是为了提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，培养学生分析问题和解决问题的能力。通过实验，要求学生能在原有的相关理论知识基础上较全面和深入理解分子生物学基本原理，掌握基本的分子生物学实验方法和技巧，初步具备一定的实验设计能力，以

2、求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。本实验课在方法上力求经典，实验内容涉及了质粒DNA的提取及限制性内切酶酶切质粒分析；大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA转化大肠杆菌；应用多聚酶链式反应（PCR）体外基因扩增及产物鉴定；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量等分子生物学的基本理论。二、学时分配章次标题实验学时每组人数备注实验一碱裂解法小量提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳检测62综合实验实验二质粒DNA的限制性内切酶消化及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定62验证实验实验三PCR技术体外扩增DNA扩增、产物回收及电泳检测82验证实验实验四大肠杆菌感受

3、态的制备及质粒DNA转化大肠杆菌82综合实验实验五SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量82综合实验三、教学内容及教学基本要求实验一碱裂解法小量提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳检测一、实验特点实验类型：综合实验类别：专业基础计划学时：6每组人数：2二、实验目的1、掌握碱裂解法小量提取质粒DNA和试剂盒提取质粒DNA的原理和方法。2、掌握琼脂糖凝胶的制备及外源DNA的检测原理。3、了解质粒DNA的粗略定量方法。三、实验内容提要1、将单菌落接种于3m1含相应抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜；2、12,000rpm离心30sec，收集菌体；3、加20

4、0u1溶液I(含RNaseA100ug/ml)，振荡悬浮菌体；4、加200ul新配制的溶液II，颠倒混匀；5、溶液澄清后立即加入预冷的200u1溶液III混匀后冰上放置5~10min；6、4℃、12,000rpm离心15min，取上清，加0.7倍异丙醇混匀，室温静置5min；7、12,000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀，抽干后溶于适量水或TE，-20℃保存备用。8、取琼脂糖0.9g，加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，100℃加热溶解；　　9、平衡凝胶槽：放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）

5、；　　10、铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至50℃左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm；11、待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子；　　12、DNA样品与载体缓冲液5:1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）；13、打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm；　14、据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止；　　15、电泳完毕关闭电源，将凝胶放紫外灯下观察并拍照，观察质粒状

6、态并记录结果。四、实验仪器设备摇床、台式高速离心机、微量移液器、微量EP管、低温冰箱、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统等。五、实验操作要点1、熟练掌握质粒DNA的提取过程和注意事项。2、熟练掌握琼脂糖凝胶的制备过程和电泳检测DNA的方法及注意事项。实验二质粒DNA的限制性内切酶消化及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定一、实验特点实验类型：验证实验类别：专业基础计划学时：6每组人数：2二、实验目的1、掌握限制性内切酶的特性。2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法。三、实验内容提要1、用微量移液枪向灭菌的EP管中分别加入DNA1ug和相应的限制性内切酶反应1

7、0×缓冲液2u1，再加入去离子水使总体积为19u1将管内溶液混匀后加入1u1酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底；2、混匀反应体系后，将EP管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温2-3小时，使酶切反应完全，置于冰箱中保存备用；3、制备琼脂糖凝胶并电泳（选择合适的DNA分子量标准作为酶切产物的大小对比），分析酶切产物的正确性并记录结果，电泳方法见实验一质粒DNA的琼脂糖电泳。四、实验仪器设备微量移液器、微量EP管、加热块、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统等。五、实验操作要点1、熟练掌握酶切体系的配置及

8、注意事项。2、熟练掌握用DNA分子量标准标定酶切产物的大小。实验三多聚酶链式反应（PCR）体外DNA扩增、产