蓝莓品种及提取方法对蓝莓叶生物活性的影响

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1、蓝莓品种及提取方法对蓝莓叶生物活性的影响     蓝莓(blueberry)属于杜鹃花科越橘属植物，多年生落叶或常绿灌木。蓝莓果实含有众多功能活性物质，其营养价值日益受到人们的广泛认可。目前我国蓝莓的种植面积逐年增大，2005年已达到667hm22]，而丰富的蓝莓叶资源并未得到良好利用。一般当作废弃物直接丢弃，这既造成资源浪费又带来环境污染。研究表明，蓝莓叶中含有丰富的黄酮、原花青素、花色苷等多酚类生理活性成分，还富含多种微量元素。目前国内外对植物提取物的研究已有不少，对蓝莓叶的研究主要集中在活性物质的提取纯化、稳定性分析及其生理功能表征等方面，而对不同提取方法和成

2、熟度对蓝莓叶生物活性的影响研究较少。    本研究对不同品种，不同成熟度和不同提取方法所得的蓝莓叶提取物的生物活性进行了对比研究，测定了蓝莓叶提取物中的总酚含量、清除自由基(DPPH)能力和还原力大小，以求对蓝莓叶生物活性有一个概括研究，为深化蓝莓叶的开发利用提供有益的实验依据。1  材料与方法1.1  材料、试剂与仪器1.1.1  材料    蓝莓叶子于2012年5月和6月采自上海市青浦区现代农业园区。采摘后立即送往上海交通大学农业与生物学院，将茎叶分离，洗净，晾干。用真空冷冻干燥机将鲜叶干燥后用组织捣碎机捣碎，存放在--80℃冰箱中，备用。1.1.2  试剂  

3、  无水乙醇、甲醇、氢氧化钠、盐酸、无水碳酸钠、福林酚、没食子酸、抗坏血酸、铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯乙酸、氯化铁国药集团化学试剂有限公司；1，1---苯基一2-三硝基苯肼(DPPH)梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。1.1.3仪器    冷冻干燥机（Triad，美国Labconco公司）、水浴锅（2875，美国赛默飞世尔科技公司）、恒温振荡器（420，美国赛默飞世尔科技公司）、旋转蒸发仪(RE-52AA，巩义市予华仪器有限公司)、离心机(Z236K，德国Hermle公司)、UV-1800紫外分光光度计（Shimadzu，日本岛津国际贸易（上海）有限公

4、司）等。1.2  方法1.2.1  蓝莓叶提取    (1)50%乙醇提取：准确称取29样品，加入24mL50%的乙醇，混匀。在室温下避光振荡30min，收集提取溶液，随后以转速12400r/min离心10min。上清液先用滤纸后用0.2μm的醋酸纤维素膜过滤。滤液旋转蒸发后定容至50mL并保存于--80℃冰箱，测试时间不超过1个月。    (2)95%乙醇提取：准确称称取59干燥样品，用95%的乙醇在50℃下振荡提取2次，每次用量约为33.33mL，时间30min。离心并将上清液合并，40℃旋转蒸发浓缩后，将提取液转移至50mL的容量瓶中，用70%的乙醇溶液定容。

5、保存于--80℃条件，备用。    (3)酸碱提取：准确称取59干燥样品，加入20mL2mol/LHC1，在沸水浴1.5h。冷却后，加入20mL2mol/LNaOH，用70%的甲醇定容至100mL。混合液在室温中放置40min，随后在19000r/min下离心5min。上清液保存于--80℃条件，备用。1.2.2  总酚的测定。    采用福林酚方法测定。取200μL-定浓度的提取物，加入1mL的福林酚试剂，充分混匀后加入0.8mL的20%的Na2C03溶液，充分混匀，在40℃水浴中反应20min，在765nm的波长下测吸光度。结果以没食子酸含量表示。1.2.3  

6、抗氧化性的测定    (1)清除自由基能力(DPPH)的测定：取0.75mL适当浓度的蓝莓提取液与1.5mL的0.09mg/mLDPPH甲醇溶液漩涡振荡混匀。在室温下避光放置5min，在517nm条件下测定吸光度。以抗坏血酸做标曲，并计算抗氧化物含量。    (2)总抗氧化能力的测定：方法参照Kuda等方法。将1.0mL的提取物溶液与2.5mL的磷酸盐缓冲溶液(50mmol/L，pH7.0)和2.5mL的铁氰化钾(1%)溶液充分混合，在50℃下反应20min。反应后加入2.5mL的三氯乙酸(10%)并离心(3000r/min)10min。取1.25mL的上清液加入1

7、.25mL的蒸馏水和0.25mL的氯化铁(0.1%)溶液混匀。在700nm的波长下测其吸光度，吸光值越高，表示试样还原能力越强。对照试验加入 BHT和单宁酸。2  结果与分析2.1  不同品种蓝莓叶提取物的总酚含量    没食子酸标准曲线。回归方程为y一13.413α+0.1066，R2:0.9960，其中y为实验所得的吸光值，z为样品浓度(mg/mL)。结果表明，没食子酸浓度在0～0.06mg/mL范围内具有良好的线性关系。    同一成熟度、品种，不同提取方法的蓝莓叶中的总酚含量具有显著性差异，不同提取方法中的总酚含量从大到小依次为方法1（50%乙醇振荡提取