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1、1.DNA测序样品的要求 2.常用载体特征 3.PCR类型测序模板注意事项 4.DNA测序常见问题分析及解决办法总结 5.测序常见问题分析DNA测序样品的要求未纯化PCR产物的要求1.片段大于200bp；2.请提供50ulPCR扩增产物(总量1ug-2ug)；3.取3ul样品，应该能够清晰的分辨出目的条带；自带引物，引物浓度不低于5uM,并请注明。 备注 纯化后PCR产物的要求1.PCR产物溶于蒸馏水中(请勿溶解在TE溶液中)；2.浓度大于20ng/ul，体积大于10ul，长片段需适当增加量
2、；3.电泳检测条带专一；自带引物。 所有模板均应提供相应的引物信息自带质粒的要求1.质粒溶于30~50ulddH2O中(请勿溶解在TE溶液中)，电泳检测浓度大50ng/ul；2.建议用相关试剂盒提取质粒；3.如有可能，同时提供1ml含有相应质粒的菌液备用；4.需注明载体和插入目的片段长度、以及测序要求。 菌样模板的要求1.说明载体抗性类型，我们提供Amp,Kan,Tet及Chl四种抗生素；2.其余类型抗生素需自备；应为高拷贝质粒，对于低拷贝质粒，请直接提供约1mg纯化质粒；3.提供1ml左右过夜培
3、养（12h）的菌液，加15%灭菌甘油，于Eppendorf管中封口保存，防止交叉污染或渗漏；4.大量样品测序，建议在一次性塑料培养皿固体培养基上穿刺培养；5.建议尽量提供穿刺培养或斜面培养的菌种（装在EP管中）。自带引物的要求1.浓度不低于5pmol/ul(或5umol/L)，溶液体积15-50ul；2.随机引物（RAPD引物）和简并引物以及引物长度不足15bp不能用于测序；3.尽可能提供引物全序列、PCR退火温度，以供参考。 本公司提供如下通用测序引物：M13+，M13-，T7,SP6,T7ter
4、，BGHrev,pGL3+,pGL3-，pGEX5’，pGEX3’，5’AOX，3’AOX，a-factor。其他引物请自带或提供序列由我们合成。常用载体特征载体大小抗性标记测序引物备注pALTER-15676bpamps,tetrT7,SP6 pALTER-Ex5835bpamps,tetrT7,SP6,T7ter, pALTER-MAX5534bpamps,cmrT7,T3 pBluscript2950bpampM13-,T3/T7,M13+ pBK-CMV4513bpkan,tetT7,T3
5、pBR3224363bptetpBRprimerPromegapcDNA3.15.4kbamp,neoT7,BGHrev. pCEP410.4kbampM13+/M13- pCI-neo5472bpamp,kanT7,T3PromegapCR2.13.9kbamp,kanM13+/M13-,T7InvitrogenPCR3.15060bpamp,kanT7,BGHRev.InvitrogenpEF6/v5-His-TOPO5840bpampT7,BGHrev.InvitrogenpET-15b570
6、8bpampT7,T7ter pET-28a-c(+)5369bpampT7,T7ter pGEM-Tvector3000bpampM13+,T7/SP6,M13-PromegapGEM–xZseries~3000bpampSP6,T7PromegapGEMEX–xseries~4000bpampT7ter,SP6,T3,T7PromegapGL3-basic4818bpamppGL3-/pGL3+PromegaPLNCX26.1kb ClontechPLXSN5.9kb ClontechpT-
7、Adv3.9kbamp,kanM13+/M13-,T7 pT7Blue2887bpampT7,M13+/M13-NovagenpTriplEx23.6kbampT7ClontechPTYB1,2,3,4 T7 pUC18/192686bpampM13+/M13- pUC118/1193200bpampM13+/M13- pUCm-T2773bpampM13+,T7/M13-TakarapSelect-15680bptetSP6,T7,M13+/M13- pSP系列18-65~3000bp,ampS
8、P6,T7 pSP系列70-73~2450bpampSP6,T7PromegapT3/T7 ampT3,T7 M13mp18/19RF7249bp无M13+/M13-TaKaRapMD18-Tvector2692bpampM13+/M13-TaKaRapKF32246bpchlpKF3primerTaKaRapKF18k2204bpkanM13+/M13-TaKaRapTZ19UpTZ19R2862bpampM13+/M13-TaKaRaλgt10system4334
