db33 t 536-2005 动物尿样中莱克多巴胺的测定

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1、DB33/T××××—2005浙江省质量技术监督局发布2005-03-18实施2005-02-17发布动物尿样中莱克多巴胺的测定DeterminationofractopamineinanimalurineDB33/T536—2005DB33浙江省地方标准ICS65.120B46备案号：1DB33/T536—2005前言本标准由浙江省农业厅提出并归口。本标准由浙江省畜产品质量安全检测中心、浙江省疾病预防控制中心负责起草，浙江一星集团饲料有限责任公司参与起草。本标准主要起草人：应永飞、吴平谷、陆春波、林仙军、周文海、任玉琴、屈健、浦琴华。I

2、DB33/T536—2005动物尿样中莱克多巴胺的测定1　范围本标准规定了以酶联免疫（ELISA）法、高效液相色谱（HPLC）法和气相色谱－质谱（GC－MS）法检测动物尿样中莱克多巴胺的方法，规定GC－MS法为仲裁法。本标准适用于动物尿样中莱克多巴胺的测定。酶联免疫（ELISA）法为筛选方法，检测限为5μg/L，高效液相色谱（HPLC）法和气相色谱－质谱（GC－MS）法为定量方法，定量限HPLC法为5μg/L、GC－MS法为1μg/L。线性范围：酶联免疫（ELISA）法为0.005ng-0.05ng，高效液相色谱（HPLC）法为2.5ng

3、-10ng，气相色谱－质谱（GC－MS）法为0.05ng-1.0ng。2　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法3　试样制备采集的尿样应保存于4℃左右的冰箱中。尿样如有混浊，应经离心处理。第一法酶联免疫法4　原理与方法4.1　原理本方法是酶联免疫法中的竞争性测定法，其

4、主要原理是：吸附在孔内的莱克多巴胺与标准或样品中的莱克多巴胺竞争性地与莱克多巴胺抗体相结合，与标准品或样品相结合的莱克多巴胺抗体被洗涤去除后，只剩下与微孔内药物相结合的抗体，其再与加入的酶标记的第二抗体相结合，酶底物在酶作用下产生蓝色产物，吸光度的高低与样品中莱克多巴胺的含量成反比。4.2　方法采用莱克多巴胺酶联免疫试剂盒或类似产品，按试剂盒说明书操作。5　试剂和溶液5.1　除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T6682二级水的规定。5.2　PBS缓冲液：用水10倍稀释厂商提供的浓缩PBS缓冲液。5.3　工作洗液

5、：用水20倍稀释厂商提供的浓缩洗液。5.4　第二抗体工作液：用第二抗体稀释液2500倍稀释第二抗体。6　仪器与设备6.1　微孔板酶标仪(带450nm滤光片)。6DB33/T536—20051.1　振荡器。1.2　冷冻离心机。1.3　微量加样器及配套吸头：20μL,50μL,100μL,200μL。1.4　冰箱。1.5　洗板机。1.6　生化培养箱。1.7　分析天平：感量0.01g。2　测定步骤2.1　注意事项不同品牌的试剂盒其操作步骤可能略有差别，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。2.2　样品处理把试样于4000rpm的转速离心1

6、0min，取上清液用PBS缓冲液（5.1）稀释十倍后直接加入微孔进行ELISA测定。2.3　测试程序2.3.1.1　根据所测定样品及标准数，计算出所需微孔条数，将微孔条插入微孔架，标准和样品做两个孔的平行重复，记录标准和样品的位置。2.3.1.2　加入50μL的标准品和处理好的样品到各自的微孔中，标准和样品做两个平行重复。2.3.1.3　加入100μL第一抗体溶液到每一个微孔中，在37℃孵育30分钟后倒出孔中的液体，将微孔架倒置在洗水纸上拍打（每轮拍打3次）以保证完全除去孔中的液体，再加入工作洗液（5.2）250μL，重复操作两遍。最后用

7、吸水纸吸干。2.3.1.4　加入150μL稀释的酶标记的第二抗体（5.3）37℃孵育30分钟后倒出孔中的液体，将微孔架倒置在洗水纸上拍打（每轮拍打3次）以保证完全除去孔中的液体，再加入工作洗液（5.2）250μL，重复操作两遍。最后用吸水纸吸干。2.3.1.5　加入100μL酶底物液到微孔中，充分混合并在室温孵育5-10min。2.3.1.6　加入50μL反应终止液到微孔中，混合后在450nm处测量吸光度值。3　结果计算以空白（浓度为0的标准溶液）吸光度值为100%计算，折算出各标准和样品的相对吸光度值。标准的吸光度值(或样品)相对吸光度

8、值（%）=×100空白的吸光度值计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应浓度(ng/L)的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在200-2000ng/L范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度(ng