多糖衍生物用于蛋白质复性及天然胶乳改性的研究

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1、中山大学博士后学位论文多糖衍生物用于蛋白质复性及天然胶乳改性的研究姓名：陈继平申请学位级别：博士后专业：高分子化学与物理指导教师：张黎明摘要环糊精和温敏聚合物聚Ⅲ．异丙基丙烯酰胺）（ＰＮＩＰＡ）对蛋白质的复性均有良好的促进作用，那么经ＰＮＩＰＡ改性后的环糊精衍生物能否更有效促进变性蛋白质的复性呢？为此，我们将氨基．１３．环糊精（ＥＤＡ．１３一ＣＤ）和带末端羧基的聚Ｎ一异丙基丙烯酰胺（ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ）偶联得到了一种温敏Ｂ一环糊精衍生物（１３．ＣＤ．ＰＮｍＡ），分别考察其在不同变性体系、不同１３－ＣＤ。ＰＮＩＰＡ浓度、不同复性温度以及在

2、表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）存在下对溶菌酶的复性效果；通过与ＥＤＡ．１３．ＣＤ和ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ的对比分析，揭示了１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分子中的环糊精空腔与ＰＮＩＰＡ链段的协同作用，并使用荧光光谱法进行了验证。实验结果表明：ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对盐酸胍变性溶菌酶的复性具有抑制作用，但对尿素变性溶菌酶的复性具有促进作用；在常温下，０．４ｍｇ／ｍＬ的ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ可使ｌｍｇ／ｍＬ溶菌酶的复性率增加至８３．７％，而直接稀释法仅为５５．８％；１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性温度应略小于１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的相转变温

3、度（ＬＣＳＴ，３３．６。Ｃ），高于这一温度时会由于ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ发生相变而导致溶菌酶的复性率急剧降低；将１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ在ＣＴＡＢ辅助溶菌酶复性一段时间（如１２ｈ）后再加入到复性体系，溶菌酶的复性效果更佳。在辅助溶菌酶复性的过程中，１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ分子中的环糊精空腔与ＰＮＩＰＡ链段可以同时促进溶菌酶的复性，荧光光谱实验结果证实了这～结论。针对天然乳胶（ＮＲＬ）ＩｔｉｌＪ品蛋白质过敏及乳胶制品的生物降解问题，考察了海藻酸钠、透明质酸及羧甲基纤维素的氧化产物氧化海藻酸钠（ＯＳＡ）、氧化透明质酸（ＯＨＡ）和氧化羧甲基纤维素（Ｏ

4、ＣＭＣ）对天然胶乳中的蛋白质的固定作用，对比了这三种氧化多糖对乳胶蛋白质的固定效果，分析了加入氧化多糖后蛋白质在乳胶膜中的分布情况，讨论了氧化多糖含量以及氧化多糖分子中的醛基含量对乳胶膜的力学性能、热降解及生物降解过程的影响。实验结果显示，三种氧化多糖对天然乳胶中蛋白质都具有很好的固定作用；以ＯＳＡ为研究对象表明，乳胶膜中ＯＳＡ含量越多，乳胶膜中水溶性蛋白质（ＷＳＰ）析出率越低，当ＯＳＡ占干乳胶的１．６７ｗｔ％时，乳胶膜ＷＳＰ的溶出率即趋近于０；ＯＳＡ中醛基含量越多，ＷＳＰ溶出率越低，当ＯＳＡ醛基含量为４．８ｍｍｏｌ／ｇ时，仅用０．３３ｗ

5、ｔ％（以固含量计）的ＯＳＡｔｉＰ可使乳胶膜中形孓晰出率低于５０｝ｌ眈。未加ＯＳＡ的乳胶膜在土埋２５天后的质量损失率为５叭％左右，之后质量不再发生明显改变；而含有ＯＳＡ的乳胶膜在土埋２５天后质量继续下降，其质量损失率超过乳胶中非橡胶成份所占的百分率，且ＯＳＡ用量越大，乳胶膜的质量损失率越大。同时，氧化多糖对乳胶膜的力学性能无明显的影响。关键词：ｐ一环糊精，聚（Ｎ一异丙基丙烯酰胺），溶菌酶，复性，天然胶乳，多糖衍生物，蛋白质固定，降解第一章温敏ｐ．环糊精衍生物用于蛋白质复性的研究１．１引言由于环糊精分子中含有疏水性空腔，客体分子能从宽口端进入

6、其分子空腔形成包络化合物。因此在使用表面活性剂辅助蛋白质复性时，常常需要加入环糊精以剥离与蛋白质形成胶束的表面活性剂或去污剂【１‘３１。Ｋａｎｌｐｐｉａｈ等人【４１发现，向盐酸胍变性的碳酸脱水酶（ＣＡＢ）复性稀释液中加入适量ｐ一环糊精（Ｄ．ＣＤ）可使其复性率超过９０％。他们认为这是由于环糊精的疏水性空腔与蛋白质复性中间体的疏水性位点发生了相互作用。聚烈．异丙基丙烯酰胺）（ＰＮＩＰＡ）是一种具有温度敏感性的聚合物，在一定温度下能发生亲水／疏水（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｅ—ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）ｎ－Ｉ逆转变，在水溶液中表现为一种可逆的溶解／沉淀

7、行为【５１（在凝胶中则表现为一种可逆的溶胀／收缩行为【６】）。发生这一转变时的温度即为相转变温度（Ｌｏｗｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｓｏｌｕｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ＬＣＳＴ），而ＰＮＩＰＡ水溶液的ＬＣＳＴ在３２℃附近〔７，８Ｊ。ＰＮＩＰＡ曾被用于蛋白质的复性研究【９－１¨。如Ｌｉｎ等人【１０ｌ将ＰＮＩＰＡ用于辅助ｐ．１ａｃｔａｍａｓｅ的复性，发现其复性效率比ＰＥＧ更高，使用ＰＮＩＰＡ可使经盐酸胍变性的１３一ｌａｃｔａｍａｓｅ的活性率提高４ｌ％，而ＰＥＧ只能提高２６％。Ｌｕ等人【１１】曾采用ＳＤＳ－－ＰＡＧＥ，圆二色谱和荧光光谱等方法研究了

8、ＰＮＩＰＡ对尿素变性溶菌酶的复性机理，认为ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性作用是因为ＰＮＩＰＡ增强了蛋白质的二级结构并抑制了溶菌酶的聚集作用，从而促进蛋白质的复性。将６．ＣＤ与ＰＮＩＰＡ耦联，制备具有