《fish简介》word版

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1、FISH简介荧光原位杂交(FluorescenceInSituHybridization,简称FISH)由于其直观,快速,敏感性高和方便灵活越来越得到广泛应用,尤其是在血液学领域中.因为白血病标本比较容易取得和制备,不同类型的白血病又往往有其特异的染色体异常,FISH在白血病诊断,治疗监测,预后估计和微小残留病检测等诸方面都正成为不可缺少的重要手段.　　FISH的基本原理很简单,就是标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的DNA(玻片上的标本)退火杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况.　　FISH探针按标记

2、方法可分为直接标记和间接标记:用生物素(biotin)或地高辛(digoxingenin)标记称为间接标记,杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号,因而步骤较多,操作麻烦,其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大;直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记.由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号,省去了烦琐的免疫荧光反应,不再需要购买荧光抗体,也由于近年来荧光互的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高,直接标记的荧光探针越来越成为首选,采用多种不同颜色的荧光,方便在同一标本上同时检测多钟异常.其荧光强度和信号大小都易于在

3、普通荧光显微镜下观察,操作过程中也不需要严格避光,使FISH过程变得简便而易于操作.FISH并不能取代传统的白血病MCI诊断,但它却能使MIC分型更为准确和深入.,MIC即细胞形态学(M),免疫学和细胞遗传学(C),三者结合对白血病进行分型诊断,对不同类型的白血病采用不同治疗方案手段.随着人们对白血病的不断认识,仅进行MIC分型不够全面,还要加上对白血病的分子(M)诊断,成为MICM分型.FISH就是连接细胞遗传学和分子生物学的桥梁.FISH流程仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OLYMPUSBX51荧光显微镜；4、OLYM

4、PUSDP11数字显微照相机。FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。（6）杂交后洗涤液：20×SSC4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出

5、酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90

6、%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。检测：9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。10）每张切片使用30μl～60

7、μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。扩增：12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；17）1×PBS室温下

8、洗3次，每次2min。5、细胞核染色：1）张切片加10μl～20μlDAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。最近有一些战友对荧光原位杂交技术