广西地方标准《猪蓝耳病病毒美洲型经典株、变异株以及欧洲型毒株的检测多重反转录聚合酶链反应法》（征求意见稿）

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1、ICS11.220B41DB45广西壮族自治区地方标准DB45/TXXXXX—XXXX猪蓝耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的猪蓝耳病病毒美洲型经典株、变异株以及欧洲型毒株的检测多重反转录聚合酶链反应法MultiplexRT-PCRfordetectionofclassicalandvariantstrainofNorthAmericangenotypeandEuropeangenotypeporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus点击此处添加与国际标准一致性程度的

2、标识（本稿完成日期：2015年11月15日）XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DB45/TXXXXX—XXXX目次前言II1　范围12　术语和定义13　材料准备23.1　试剂23.2　仪器设备及耗材24　操作方法34.1　操作环境34.2　待检样品处理34.3　待检样品总　RNA提取34.4　反转录(RT)34.5　PCR　扩增34.6　阴性及阳性对照35　结果判定45.1　琼脂糖凝胶制备45.2　加样45.3　电泳条件45.4　结果判定4附录A（规范性附录）　引

3、物序列、扩增片段及结果判定5附录B（规范性附录）　试剂盒8附录C（规范性附录）　重组质粒标准品制备1011DB45/TXXXXX—XXXX前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：施开创、蒙振亩、张步娴、莫胜兰、王海清、尹彦文、韦建华、胡杰、李军。11DB45/TXXXXX—XXXX猪蓝耳病病毒美洲型经典

4、株、变异株以及欧洲型毒株的检测多重反转录聚合酶链反应法1　范围本标准规定了用于鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株、变异株以及欧洲型毒株的多重反转录聚合酶链反应法的材料准备、操作方法及结果判定。本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株、变异株以及欧洲型毒株的鉴别检测。2　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1　猪繁殖与呼吸综合征病毒porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV又称猪蓝耳病病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，其基因组为

5、单股正链RNA。2.2　猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株classicalporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，C-PRRSV指在病毒Nsp2蛋白第481位和第533~561位氨基酸未出现缺失的、以VR-2332毒株为代表的美洲基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒。2.3　猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型变异株highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，HP-PRRSV指在病毒Nsp

6、2蛋白第481位氨基酸和第533~561位氨基酸出现30个氨基酸的不连续缺失为特征的、以JXA1毒株为代表的高致病性美洲基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒。2.4　猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株Europeangenotypeporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，EU-PRRSV指以Lelystadvirus(LV)毒株为代表的欧洲基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒。该型毒株最早在欧洲分离得到。2.5　反转录reversetranscription，RT以RNA为

7、模板合成互补脱氧核糖核酸（cDNA）的过程。11DB45/TXXXXX—XXXX1.1　聚合酶链反应polymerasechainreaction，PCR是一种由热变性→复性→延伸三步反应组成一个循环，经多次循环反应，在体外快速扩增特定脱氧核糖核酸（DNA）片段的方法。1.2　多重聚合酶链反应multiplexpolymerasechainreaction，Multi-PCR简称多重PCR，是PCR技术的一种特殊形式。指在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增多个模板的PCR技术。2　材料准备2.1　试剂2.1

8、.1　特异性引物引物序列见附录A中的表A.1，上、下游引物的使用浓度均为25pmol/µL。2.1.2　RNA抽提试剂盒商业化的RNA抽提试剂盒主要成分见附录B中的B.1，使用前经技术验证合格。2.1.3　RT-PCR试剂盒商业化的RT-PCR试剂盒主要成分见附录B中的B.2，使用前经技术验证合格。2.1.4　电泳缓冲液商业化的电泳缓冲液主要成分见附录B中的B.3，使用前经技术验证合格。2.2　仪器