与重要疾病相关膜蛋白的结构和功能2009cb918800-g

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1、项目名称：与重要疾病相关膜蛋白的结构和功能首席科学家：施一公清华大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：教育部12一、研究内容本项目将主要进行以下几方面的研究：课题一解析在老年痴呆症中起关键作用的膜蛋白酶复合物γ-Secretase的高分辨率晶体结构，在此基础上设计它的抑制剂；（占总经费的32.5%）神经生物学研究证明导致奥兹海默综合症（Alzheimer’sdisease,即老年痴呆症）的重要病原之一是β-Amyloid（Aβ）多肽的积累。Aβ来源于AmyloidPrecursorProtein(APP)。APP经过几

2、次剪切最终产生出Aβ，其中有两步剪切（β和γ）是在细胞膜内进行的，而执行这种膜内剪切的蛋白酶是被称为γ-Secretase的膜整合蛋白酶。与其他膜整合蛋白酶不同的是，γ-Secretase不是一个单亚基蛋白，而是由四个亚基组成，包括Presenilin（活性位点所在亚基），Aph-1,Pen-2以及Nicastrin，四个亚基总共包含大约18个跨膜螺旋，其中Presenilin含九个，Aph-1六个，Pen-2两个，Nicastrin一个跨膜螺旋。Presenilin在γ-Secretase组装的过程中经过剪切后形成两个紧密结合的

3、结构域：NTD和CTD。其活性中心起蛋白酶水解催化作用的关键氨基酸是两个天冬氨酸（Aspartate)，但其具体催化机制至今没有准确解释。γ-Secretase不仅与老年痴呆症直接相关，而且越来越多的证据表明它可以切割诸多跨膜底物，从而被称为生物膜中的蛋白酶体。因此解析γ-Secretase复合物的结构具有极其重要的科学价值，其受关注程度与GPCR不相上下。根据现有科研文献报道，γ-Secretase复合物已经在昆虫细胞及CHO哺乳动物细胞两个表达体系内成功表达及纯化，并具有生物活性，但产率偏低，还不能完全满足大规模尝试结晶的需要

4、。美国及日本的两个实验室分别用电子显微镜观察其构象，得到了15Å和55Å两个低分辨率的结构。后者由于分辨率太低，难以提取任何有实质意义的结构信息；前者的结构分析显示γ-Secretase复合物似乎包含一个亲水性通道使它的活性位点与膜的两侧相通。但是由于分辨率低，很难获得准确、肯定的结论。要揭示γ-Secretase复合物的结构、工作原理以及根据结构设计其抑制剂，必须获得其高分辨率的原子水平的结构。我们计划同时用昆虫细胞及CHO哺乳动物细胞两个体系通过共表达各个亚基来得到γ-Secretase复合物，纯化后检测其酶活性，并开始结晶的

5、探索。整个课题的瓶颈有两个，一是摸索合适的条件超量重组表达具有生物活性的γ12-Secretase复合物；二是摸索最优纯化条件及结晶条件。基于我们以前摸索的膜蛋白的研究经验，我们有信心在两至三年内解决这些瓶颈问题，进而进入到晶体学实验及结构解析。本课题中的膜蛋白还没有同源结构。我们将结合计算生物学对这些膜蛋白进行二级结构预测，帮助重组膜蛋白的工程设计，并以此作为模型系统开发膜蛋白的三级结构预测新算法，进一步开发对膜蛋白功能及其它生物化学性质的预测。将这些方法整合成一个膜蛋白结构预测和分析的系统平台。我们也将同时对项目中其他课题组的

6、目标膜蛋白进行预测分析，提供对于膜蛋白重组工程设计等方面的有利帮助，加快实验科学家对目标膜蛋白结构的实验测定。一旦我们获得γ-Secretase复合物的结构，我们将采用成熟的分子模拟技术开展膜蛋白与配基小分子的分子对接，了解配基结合的机制，开展抑制剂的计算机辅助筛选；开展膜蛋白与其它蛋白的相互作用研究；利用分子动力学模拟研究膜蛋白与其它分子结合的动态过程。通过以上计算，期望获得一些膜蛋白功能的新线索，可用于辅助实验科学家加快对目标膜蛋白的功能鉴定。课题二解析与心血管疾病有直接关系的胆固醇代谢通路中的重要膜蛋白SCAP，INSIG，

7、SERBP及S2P的高分辨率晶体结构，阐释膜蛋白调控胆固醇代谢通路的分子机理。（占总经费的22.5%）本课题包含以下几方面内容：a.SCAP调控SREBP在细胞中定位的机理：SREBP（SterolResponseElementBindingProtein）是一类极为特殊的转录因子[23]。它是通过两个跨膜螺旋被固定在内质网膜上的膜整合蛋白,起转录作用的只是它的N端可溶结构域（转录因子）。当细胞内的胆固醇含量降低的时候，这个蛋白首先要从内质网膜转移到高尔基体上，在那里它必须经过两步酶切才能将其N端可溶结构域从膜上释放出来，进而被转

8、运到细胞核中，激活与胆固醇和脂肪酸合成、吸收相关的基因表达，从而提高体内胆固醇的含量[23]。当细胞内的胆固醇水平足够高的时候,SREBP则被固定在内质网膜上。控制SREBP在细胞中定位的是一个被称为SCAP(SREBPCleavageActiva