家畜性别决定机制及性别控制的研究进展

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研究生课程考试卷学号、姓名：20102570张铁赢年级、专业：2010级动物遗传育种与繁殖培养层次：硕士课程名称： 动物胚胎工程授课学时学分：48学时3学分考试成绩：授课或主讲教师签字： 评阅人：年月日 家畜性别决定机制及性别控制的研究进展摘　要：哺乳动物的性别决定是一个多基因参与的调控过程,其直接的应用生长点为性别控制。近年来性别决定原理和性别控制方法的研究中取得了可喜的成就。本文就家畜性别决定机制、性别控制方法以及在畜牧业中的应用与展望作一综述。关键词:SRY基因;家畜;早期胚胎的性别鉴定;性别控制　　家畜性别控制(SexControl)是一项能显著提高畜牧业经济效益的生物工程技术,对家畜育种、繁殖、生产和遗传疾病的防治均有非常重要的意义。一个世纪以来,性别形成机理的研究已由形态学水平发展到分子水平,哺乳动物的性别决定依赖于Y染色体上的SRY基因(sex-determiningregionYgene),它使原始性腺发育为睾丸[1]。另外,通过对一些性反转病例的研究发现,在X染色体和常染色体上还存在一些与性别决定相关的基因[2]。因此,性别决定是一个多基因级联调控的过程。性别控制的方法也随性别决定理论研究的深入得到同步发展,从个体水平、细胞水平发展到分子水平。本文对性别决定的机制和性别控制方法的研究进展作以下介绍。1　性别决定的生物学机制1.1　性别决定遗传学机制1.1.1　Y染色体基因-SRYSinclair等发现在哺乳动物Y染色体上存在性别决定区(SexdeterminingregionofY)[3],即SRY基因。当将携带SRY基因的一段基因组片段导入XX小鼠胚胎,实现了由雌性向雄性的性反转[2],证明了SRY基因为哺乳动物的性别主宰基因。人们深入研究的结果表明SRY基因位于Y染色体短臂,从着丝粒到端粒与拟常染色体区相邻的35Kb的范围内。人类的SRY基因只有一个外显子,长850bp,该基因有一个多聚腺苷酸位点和两个转录起始点,其间是一个编码204个氨基酸的可读框,其中包含可编码79个氨基酸的保守区4/HMG盒[4] 。SRY基因的HMG盒在哺乳动物间具有高度的同源性,如牛SRY基因的HMG盒和人类的同源性达84%。SRY基因自启动转录,表达产生SRY因子。SRY因子激活下游的苗勒氏体抑制物基因MIS(副中肾抑制基因)表达,从而抑制苗勒氏管的发育,同时SRY因子抑制或对抗DSS(逆性别剂量敏感基因)基因产物,进而抑制卵巢发育,另一方面SRY因子作用于间质细胞,使之分泌睾酮,使胎儿雄性化,导致阴茎、阴囊和其他雄性器官的形成。对于雌性动物,由于SRY基因的缺少,使得X染色体短臂上DSS位点基因转录,促进卵巢发育,而卵巢产生的雌激素使苗勒氏管发育成输卵管、子宫、子宫颈、阴道等。1.1.2　X染色体上与性别决定有关的基因SOX3　SRY的相关基因。人类的SOX3基因定位于Xq27,小鼠的SOX3定位于X染色体最保守区段[5],小鼠SOX3基因是与SRY/Sry同源性最高的基因,从进化的角度来讲,SOX基因家族中没有哪一个基因比SOX3更接近SRY/Sry基因,说明它们可能起源于同一共同的祖先基因[6]。一种观点认为SOX3与SRY可能是一对等位基因,在两种性别胚胎中编码Sry结合蛋白,对胚胎的中枢神经发育和末分化的性腺起作用,SRY基因可能作为SOX3的变异形式并获得促进睾丸发育的作用[7]。DAX-1/dax-1　DAX-1/dax-1(DSS-AHCcriticalregionontheXgene1,X染色体DSS-AHC决定区基因)是位于X染色体DSS(dosage-sensitivesexreversal,剂量敏感性性反转基因)基因座区域内的一个候选基因,与先天性肾上腺发育不全基因座(adrenalhypoplasiacongeni-tal,AHC)有关,编码核内激素受体超家族成员的一个成员,在雌性个体中具有二份拷贝,在人类XY个体中DAX-1如多一个拷贝会导致性转变,这表明DAXl基因决定雌性发育。1998年有人将携带有dax-1基因的DNA片段作为外源基因导入雄性小鼠的胚胎中,结果引起睾丸发育延迟,部分引起性反转,这说明dax-1基因对Sry基因有抑制功能。也有人认为dax-1是卵巢决定基因[8]。1.1.3　常染色体上与性别决定有关的基因Wt1基因　威尔氏瘤抑制基因(wi1mstumorsup-poressorgene,Wt1[9,10],人类定位于11p13,位于小鼠的17号染色体上,其异质突变引起Denis-Drash综合症(DDS)。Wtl与间质细胞形成精巢和性腺的早期发育有关,直接激活SRY的表达。SF-1(steroidogenicfactorl,类生长因子1)　SF-1是核内激素受体超家族成员之一,位于人类染色体9q34。SF-1直接调控MIS基因的表达,诱导dax-1基因转录,它对于睾丸和肾上腺发育是必需的,另外它与wt-l相互作用调控AMH、类固醇生成因子基因的表达[11]。SOX9(SRY-relatedHMGbox9)SOX9是HMG-box家族中的一个转录激活因子,人类染色体上定位于17q24,小鼠SOX9位于11号染色体。突变分析及DNA测序证明SOX9突变可引发CD(campomelicdysplasia),实验表明SOX9是SRY表达所不可缺少的因子[12]。1.2　性别决定的发育学机制 家畜胚胎发育的早期阶段为性别未分化期,仅有位于中肾内缘的性腺原基,这种未分化的性腺中胚层处于中性[13]。家畜性别决定的取向是未来性腺发育的导向,而性别决定的结果又是通过性腺分化及性表型来体现的[14]。胚胎生殖腺的发育类型是性别形成的决定物质。对兔胚胎阉割后的试验表明,在内外生殖器组织分化的临界时间前,无论对雌性还是雄性胚胎切除发育中的生殖腺,均导致了胚胎的内外形态上向雌性发育。说明胚胎中睾丸组织的存在是促使雄性性状发育或者阻止雌性性状发育的必需物质[15]。当生殖腺原基被某种信息诱导发育为卵巢,由卵巢产生的雌激素则使苗勒氏管(mullerianduct,MD)发育为阴道、子宫和输卵管。如果性腺原基发育为睾丸,其间质细胞分泌睾酮,支持细胞分泌抗苗勒氏管因子(anti-mullerianductfactors,AMDF),诱导中肾管发育成附睾、输精管和精泡等内生殖器。生殖道中生殖腺分布和发育的异常,将导致不同程度的雌雄同性[13]。2　性别控制性别控制主要是通过两种途径,即X、Y精子的分离和早期胚胎性别的鉴定来实现的。2.1　X精子和Y精子的分离家畜性别是由受精的配子决定的,因此研究分离动物精液中X和Y精子,是解决家畜性别控制的关键问题。X、Y精子分离主要是依据两类精子理化特性的不同而进行的。研究发现X、Y精子在体积、密度、电荷、运动性和DNA含量、表面抗原等方面存在差异。X精子在长度、头部面积、周径、颈部长度、尾长等形态上显著大于Y精子,从而为分离精子提供了依据。并先后采用了流式细胞分类法、沉降法、密度梯度离心法、凝胶过滤法、电泳法、免疫学方法等种类繁多的精子分离技术对人和家畜的精子进行分离。并有控制性别比例的报道,但研究结果大多缺乏可靠性、重复性和准确性。并且后代出生的性别比例并没有明显超出自然出现的性别比例范围,实际生产中推广的意义不大。近年来发展起来的免疫学方法和细胞流式分类仪在分离两类精子的效率上则显示出较大的优势。2.1.1　流式细胞仪分离法 由于X、Y精子的DNA含量有差异,用无毒荧光染料对精子染色,染料着色量与精子DNA含量成正比,经荧光检查,X精子发出荧光强,再经计算机控制使荧光强的X精子带上正电荷,Y精子带上负电荷。带电精子通过高压电场即向不同方向偏转,从而达到分离的目的。Johnson(1994)设计出的流式细胞分类仪可将X与Y精子分开,并进行体外受精,已获得预期性别的牛、免、猪、绵羊的后代。Senger研究证实,用此法分离出的精子给母免授精,获得94%的雌性仔免,用Y精子授精获得81%雄性仔免。此法虽分离X、Y精子效果好,但分离速度很慢,且仪器价格昂贵,目前尚不能进入实用阶段。目前,采用流动细胞测定分离两类型精子尚有以下问题有待解决:分离精子的受精力比正常精子偏低;分离的精子经冷冻后的复苏率比正常精子偏低;分离冻精和分离冻精后再冷冻的问题。2.1.2　免疫学分离法应用免疫学方法分离精子是从Eichwald和Silmser(1955)发现雄性特异性弱组织相容性Y抗原(malespecificminorhistocmpatibility-Yantigen,简称H-Y抗原),后逐渐发展起来的。利用免疫反应识别X和Y精子,以达到性别控制的目的。Zavos将H-Y抗血清直接注射到兔阴道内,得到的雄性率高达74.2%。Jones等(1992)用免疫磁力选择法成功高效地分离出X、Y精子。有人预测此法可能是快速、低成本分离X、Y精子的理想方法。2.2　早期胚胎的性别鉴定胚胎性别鉴定主要是通过鉴定胚胎的性别,以影响出生的性比例。早期胚胎性别鉴定方法主要有细胞学方法、免疫学方法、分子生物学方法等。2.2.1　细胞遗传学鉴定细胞遗传方法又称核型分析法。具体方法是在胚胎滋养层上取一部分细胞,先用秋水仙素处理,再固定染色,检查性染色体,根据染色体中期的谱带差异、Y染色体的大小及形态判断性别,准确率达100%。但这种方法费时费力,要求操作人员经验丰富,目前在实践中难以推广。2.2.2　X-相关酶法 一般在哺乳动物中雌性带有两条X染色体,而雄性则带有一条X染色体和一条Y染色体。在胚胎发育早期,雌性的一条X染色体失活以保持两性间的基因等量。但在失活前雌胚X-相关酶活性是雄性的2倍,这些相关酶有6-磷酸葡萄糖脱氢酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶,根据这些酶与底物的颜色反应检测胚胎性别。Willams等(1986)用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)检查,发现雌、雄胚胎鉴别率为72%和46%。由于X染色体失活的确切时间尚不明确,可能把失活的雌胚误判为雄胚,从而影响其鉴别的准确性。为进一步提高鉴别的精确度,首先要确定X染色体失活的准确时间。Monk(1977)和Kratzer(1978)研究发现桑椹胚后期到囊胚的早、中期可以看到很好的双峰分布曲线,而到囊胚后期,双峰分布消失,这被认为是由于雌性胚胎中一条x染色体失活所致。2.2.3　免疫法免疫学方法是利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗原,从而进行胚胎性别鉴定的一种方法。对胚胎的H-Y抗原检测有三种方法:细胞毒性分析法、间接免疫荧光分析法和囊胚形成抑制法。细胞毒性分析法是将H-Y抗血清与补体(豚鼠血清)加入培养液中对胚胎进行培养,将在培养过程中继续发育的胚胎分类为H-Y-(雌性),将出现个别卵裂球溶解以及不能发育到囊胚期者分类为H-Y+(雄性)。用这种方法鉴定的H-Y-胚胎移植后所生仔鼠有86%为雌性。但该方法是以破坏一部分胚胎(雄性)为代价的,近年来已很少采用。间接免疫荧光法(IndirectImmunofluorescenceAssay)是将胚胎先用H-Y抗体处理30min,再用异硫氰酸盐荧光素(FITC)标记的二抗处理,根据特异荧光来判断,有荧光者为雄胚,无荧光者为雌胚,将两类胚胎移植后,判为雄胚者有78%发育成雄鼠,判为雌胚者有81%发育为雌鼠。在牛有89%的雌性鉴定准确率,猪为81%的鉴定准确宰,绵羊有85%的准确率。此方法的主要优点是不损害胚胎,亦具有适当的性别鉴定准确率,但对荧光强度的估价则具有高度的主观性。此外胚胎质量似乎也与荧光强度和类型有关,第二抗体有时发生非特异性结合,如与同卵周隙的细胞碎片结合等。囊胚形成抑制法是利用H-Y抗体对雄性桑椹胚向囊胚发育具有可逆性抑制(Utsumi等,1983)的原理发展起的一种胚胎性别鉴定法。内海恭三(1989)将大鼠H-Y抗体与大鼠桑根胚共同培养6h,形成囊胚者判雌性胚,末形成囊胚者判为雄性胚。雄性胚除去H-Y抗体后再培养数小时,还可形成囊胚。将这两种胚胎移植后分别获得了79%(38/48)的雌鼠和91.3%(21/23)的雄鼠。看来这种方法也是一种简单而有效的胚胎性别鉴定方法,但其不足之处是容易将一部分发育迟缓的雄性胚胎误判为雌性胚胎。此外,在实际工作中,如不是通过体外受精,很难同时获得刚好处于桑椹胚期的大量胚胎而不至于浪费桑椹胚以前及整胚以后的胚胎。2.2.4　分子生物学方法分子生物学方法是近10 年来发展起来的一种利用雄性特异性基因探针和PCR扩增技术鉴别家畜胚胎性别的新方法。其实质就是检测Y染色体上的SRY基因的有无,有则判断为雄性,无则判断为雌性。DNA探针法是从胚胎取下少量细胞,将其DNA与Y染色体特异标记的DNA序列(探针)杂交,结果如为阳性,则为雄性胚胎,否则为雌性胚胎。探针的标记物现有两种,一种为放射性同位素,一种为生物素。前者需要大量的胚胎细胞和较长的时间(一般同位素低温曝光需7-8d);后者设备简单,技术难度较大,所需时间较短(一般为24h),但可鉴定的胚胎较少。PCR扩增法是应用PCR技术对家畜胚胎进行性别鉴定就是建立家畜Y染色体DNA文库及筛选得到特异的克隆并进行测序的基础上,设计并合成一对与Y染色体特异性片段两端的正链和负链相配对的小片段单链核苷酸引物(长度在20bp左右)。并在胚胎分割技术的支持下,用少部分分割胚细胞中的DNA为模扳进行PCR扩增。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并用BE染色后紫外光检测,出现特异带的是雄性胚胎,否则为雌性胚胎。该方法具有快速、敏感、简便的优点,目前已被国内外研究人员广泛用于家畜胚胎的性别鉴定。但最大问题是污染,因而在操作过程中要更进一步严格操作程序,以避免外源DNA污染。3　应用与展望畜牧业的发展促进了家畜性别控制的研究,而同时性别控制的方法应用于实践,对畜牧业发展产生了巨大的推动作用。近几年,科学工作者进行了大量关于控制性别方法的实用性研究,其中许多已经得到了应用。尽管人们对性别控制做了大量工作,也取得了一定成果,但距离对生物性别进行有效控制或使用胚胎性别鉴定达到实用化水平还有一定差距。因各种实用性因素如需求、成本、时间、数量和准确性限制了实验室性别控制技术的应用。今后应该在对性别决定更深的研究成果基础上,着重那些快速、准确、经济的胚胎性别鉴定方法,以便将这些技术更好地应用于实际,促进畜牧业的迅速发展。参考文献:[1]　GubbyJ,CollignonJ,KoopmanP,eta1.AgenemappingtothesexdeterminingregionofthemouseYchromo-someisamemberofthenovelfamlilyembryonicallyex-pressedgenes[J].Nature,1990,346:245.[2]　BardonB,ZanariaF,Guiolis,etal.AdosagesensitivelocusatchromosomeXp21isinvolvedinmaletofemalesexrevesal[J].Nat.genet.,1994,7(4):497.[3]　SinclairAH.AgenefromthehumansexdeterminingregionencodesaproteinwithhomologytoaconservedDNA-bindingmotif[J].Nature,1990,346:240.[4]　Lovell-badgeR.ThemoleculargeneticsofSRYanditroleinmammaliansexdetermination[J].PhilTransRSocLond,1995,350(1333):205.[5]　SteranovicM.ZuffardQ,CollignonJ,etal.ThecD-NAsquenceandchromosomelocation 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