《dna的提取》word版

《《dna的提取》word版》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、基因组DNA提取方法基因组DNA提取方法'U.h2_9x"p0E+z5p0Y　　植被基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等。&q:V*v3h"F/P7

2、^-q试验步骤：)h)I2h6W5`9i5G&r1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。6y4}'l(?8Y)H&t+}  R2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。.h(b9t(n%p-S%?$M(]2m$J3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀。,z  V1W,G#A4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,2q/T/G4P  `  X0]/v'u&o5、

3、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相。  j#i0b)Q,S*

4、*P%L+s6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。,c5w"i/H#

5、-e7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。,b$K+E'C2J  2500rpm,离心10min。弃上清。$r0T*O%a1P8L%h6g(t$p1L8、加入0.1倍

6、体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。(P3r9u9

7、0Y5g*e&F"I9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。外周血DNA提取技术外周血DNA提取技术*_2x(S/Q-^!a2{分离外周血白细胞提取方法：6B"_8y6c!Z:K2[试验步骤：8p7W6{#Y3s1d(c;Z0d!}*I1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。-t3m!R3^6T#b2、小心吸取上层血浆，分装到3个0

8、.5ml离心管中。6I!{  _,n$k6M;P/^)i3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。1w3Y7y4o'M5c3j4、2500rpm离心10min，弃上清。+T4f-x3X9;p&k/g,O"j5V5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。4_+w/`&i6S;Y)_#j6、3000rpm离心10min，弃上清。/o%y-w+?3t%E+b7、倒置离心管，去掉残液。6H/O/

9、3O!]8、得白细胞，－80?C冻存。,["@)

10、3^:d;i"B试验要求：5Q(j*_

11、.C0x"K　　血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。  p;T.Q(t#w#@'M0s%_4L7w0@'K#k6H,l4S氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：$I&v2o-v-q3t试验试剂：'E1J$u1E#P7LLigsisbuffer：133mMNH4ClNHCl7.12g  0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g  0.1mMEDTA0.5mM  EDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。!E)I/t)

12、.Q

13、7~0P0zACD抗凝剂：柠檬酸1.68g  柠檬酸钠4.62g  葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。5U-V0v8z&y"f9Y提取缓冲液（Extractionbuffer）：10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml  0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml  0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌。3?.U$P*g"l"H;y,S&x试验步骤："L+B"h

14、1Y7F(O1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。2?3~%V!y3O'[  C;`9J2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。(K,X&j!J1a/q3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。%z6U'Y6&@(B2w4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但