检验医学专业实验iv临床微生物学检验部分

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1、细菌形态学检查一、不染色标本检查(压滴法)【操作方法】1、用接种环取大肠杆菌菌液2-3环,置于洁净载玻片中央。2、取一张洁净盖玻片从菌液一边缓缓放下,覆盖于菌液上,避免菌液中产生气泡。3、先用低倍镜找到观察部位,再换高倍镜观察细菌的运动。【结果观察】有动力:可看到细菌自一处移至另一处,有明显的方向性位移无动力:细菌呈现布朗运动,只在原地颤动而无位置的改变二、革兰染色法【步骤】:制片、染色、镜检1、制片涂片:取洁净载玻片一张,用接种环取生理盐水2环,置于玻片上,接种环灭菌后,取细菌培养物少许与盐水混匀,并涂成均匀薄膜涂片。如用液体材料,如痰、尿液

2、、脓汁等可直接涂片,不必加生理盐水。干燥:涂片最好在室温下自然干燥,必要时可将标本面向上,小心间断地在弱火高处烘干,但切勿紧靠火焰将涂膜烤枯。固定:涂片干燥后,将标本片在酒精灯上快速的来回通过三次,共约2s~3s,注意温度不可太高,以涂片涂膜的反面触及皮肤觉轻微烫觉即可。固定目的:①杀死细菌;②使菌体与玻片粘附较牢,在染色时不致被染液和水冲掉;③菌体蛋白变性易着色。2、染色结晶紫初染1min→卢戈氏碘液媒染1min→95%酒精脱色30sec~1min→稀释石炭酸复红复染1min,油镜观察【原理】:①革兰阳性细菌细胞壁结构较致密,肽聚糖层厚,脂质

3、含量少,乙醇不易渗入;革兰阴性菌细胞壁结构较疏松,肽聚糖层少,脂质含量多,乙醇易渗入。②革兰阳性菌的等电点低,革兰阴性菌的等电点较高,在相同pH条件下,革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多,与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固不易脱色。③革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐,可与结晶紫和碘牢固的结合成大分子复合物,不易被乙醇脱色;而革兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐,吸附染料量少,形成的复合物分子也较小,故易被乙醇脱色。【结果观察】:紫色为阳性,红色为阴性【影响因素】①操作因素:涂片太薄或太厚,固定时菌体过分受热,以及脱色时间长短,都会影响染色结

4、果②染液因素:所有染液应防止染液蒸发而改变浓度,特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用;涂片积水过多会改变染液浓度,影响染色效果【意义】:①鉴定细菌:可将细菌分为革兰阳性菌(紫色)和革兰阴性菌(红色),②观察致病性:大多数G+菌以外毒素为主要致病物质,而G-菌以内毒素为主要致病物质。两者的致病机制和临床表现各不相同,③参考选择抗菌药物:大多数G+菌对青霉素、头孢菌素等敏感;大多数G-菌对氨基苷类抗生素如链霉素、庆大霉素等敏感。【用途】:一般细菌学检查或鉴定三、细菌的形态及排列方式:①杆菌②球菌(包括:葡萄球菌、双球菌、链球菌、四联球菌和八

5、叠球菌)③螺形菌(菌体仅有一个弯曲呈弧形的螺形菌称为弧菌;菌体有数个弯曲的螺形菌称为螺菌;菌体细长、弯曲呈弧形的螺形菌称为螺杆菌)四、细菌特殊结构的观察芽孢:破伤风杆菌(革兰染色法)荚膜:肺炎双球菌(革兰染色法)鞭毛:变形杆菌(革兰染色法观察不到,需用特殊染色法,如镀银染色)培养基的制备【分类】按物理性状分为:液体培养基(多用于增菌)、固体培养基(多用于分离纯化鉴定细菌)、半固体培养基(用于观察动力、短期保存)按营养组成和用途分为:基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、特殊培养基【步骤和方法】:1、计算用量,2、调配成分,3、溶解,4

6、、校正pH值,5、分装,6、灭菌:选择合适的灭菌方法。7、质量控制:需做无菌试验和效果试验。8、保存:注明名称、日期,置冰箱或冷暗处。【配方】肉汤培养基:蛋白胨1g,牛肉膏0.3g,NaCl0.5g,蒸馏水定容至100ml,调pH至7.4-7.6,分装,高磅灭菌20分钟。有成品培养基,直接按说明操作。(作为无糖基础培养基用,适用于营养条件一般的细菌)尿素培养基:蛋白胨1g,NaCl5g,葡萄糖1g,尿素20g,KH2PO42g,2g/L酚红6ml,加蒸馏水定容至1000ml,调pH小于6.8,分装,低磅灭菌10分钟。葡萄糖蛋白胨培养基:蛋白胨7

7、g,葡萄糖5g,K2HPO45g,蒸馏水定容至1000ml,调pH至7.2-7.4,分装,低磅灭菌15分钟。苯丙氨酸培养基:酵母浸膏3g,NaCl5g,Na2HPO41g,L-苯丙氨酸2g,琼脂12g,蒸馏水定容至1000ml,调pH至7.2-7.4,趁热分装成2ml/支,低磅灭菌,摆斜面。【注意事项】1、培养基的调配溶解:现在锥形瓶底加入少量水,再加入蛋白胨等成分,以防其粘瓶底烧结。制备大量培养基时,除玻璃容器外,还可用铝锅、搪瓷桶,但不可用铜铁容器,以免其离子进入培养基(培养基中铜含量超过0.3g/L会抑制细菌生长,含铁量超过0.14mg/

8、L时会抑制细菌毒素产生)。如需在培养基中加染料、胆盐、指示剂等成分时,应在校正pH后加入2、培养基的澄清:如需制备澄清的培养基,可用卵蛋白加热澄清法:

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