基因工程实验教学教案

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1、基因工程实验教学方案湖南人文科技学院生命科学系生物技术教研室实验一重组质粒的提取及转化表达型菌株Ⅰ质粒DNA的提取实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。实验原理1．碱变性法基本原理是，在Ph12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚

2、氯仿或硅基质膜柱子进一步纯化DNA。2．设计构建体外重组DNA分子构建体外重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱。选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有识别位点，也就是说用一种或两种限制性内切酶就能切割得到完整的外源DNA基因。构建体外重组DNA分子，最简单的重组方式就是在目的基因DNA的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解，产生两个不同的粘性末端。再用这两种限制性内切酶去选择合适的载体进行酶切，也产生这两个不同的粘性末端，这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的，重组的效率高，也易于筛选处重组子。附表达载体p

3、GEX-6P-1-mreB的构建图：仪器材料与试剂（一）仪器1．恒温摇床2．台式离心机3．漩涡混合仪（二）材料与试剂1．含pGEX-6P-1-mreB质粒的大肠杆菌DH5α2．含pGEX-6P-1质粒的大肠杆菌DH5α3．液体LB培养基4．100mg/mL氨苄青霉素Amp5．新捷质粒提取试剂盒实验步骤分为两组：一组提取质粒pGEX-6P-1-mreB，另一组提取质粒pGEX-6P-1。1）12000rmp离心30秒收集1-5ml过夜培养的细菌，弃尽培养基。加入250ul已加入RnaseA的BufferⅠ,充分悬浮细菌沉淀。2）加入250ulBuff

4、erⅡ,温和并充分地翻转离心管4-6次。3）加入350ulBufferⅢ,温和并充分地翻转离心管4-6次。4）13000rmp离心10分钟。5）将核酸纯化柱置于2ml离心管中，转移步骤4中的上清液到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rmp离心30秒。6）弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700ulBufferW2,盖上管盖，12000rmp离心30秒。7）弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化住置回到2ml离心管中，14000rmp离心1分钟。8）弃2ml离心管，将核酸纯化住置于一个洁净的1.5ml离心管中，在

5、纯化柱的膜中央加入50-100ulBufferTE,盖上管盖，室温静置1分钟，12000rmp离心30秒。9）弃纯化柱，洗脱的质粒可立即用于各种生物学实验，或储存于-20℃。实验结果实验安排3个小时Ⅱ质粒DNA的转化实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌转化的方法与技术。实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态。转化是指质粒DNA或以其为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃、CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸DNA复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA

6、复合物。将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细胞培养物涂在选择性培养基上。E.coliDH5α是一种用于质粒克隆的菌株。E.coliBL21是一种适合于外源蛋白表达的菌株，其内源性的蛋白酶基因缺失。仪器材料与试剂（一）仪器1.超净工作台2.恒温摇床3.制冰机4.高压灭菌锅(二)材料与试剂1.大肠杆菌Bl21感受态细胞2.质粒DNA：pGEX-6P-1-mreB、pGEX-6P-1。3．固体LB培养基平板（含Amp120ug/ml）实验步骤分为两组：一组加入质粒pGEX-6P-1-

7、mreB，另一组加入质粒pGEX-6P-1。1.取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰上放置30min。同时做一个对照管，仅加入100ul感受态细胞，不加质粒。2.将管放到42℃热击90s。3.冰浴2min。4.每管加400ulLB液体培养基，37℃培养1h(150r/min)5．将适当体积（200ul）的复苏细胞，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养皿中，正置平皿30min。6.倒置平皿37℃培养12-16h,出现菌落。实验结果实验安排这整个大实验从质粒提取到转化需一天，第二天早晨观察结果。实验二外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和

8、检测Ⅰ外源基因在大肠杆菌中的诱导表达实验目的通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。实验原理将外源基因mreB