课堂新坐标20162017版高中生物第1部分微生物的利用实验1大肠杆菌的培养和分离教案浙科版

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1、实验1大肠杆菌的培养和分离课　标　解　读重　点　难　点1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。1.微生物实验的无菌操作。2.利用LB液体培养基进行细菌培养。3.利用LB固体培养基分离大肠杆菌。4.划线分离法和涂布分离法。一、大肠杆菌1．大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。2．在肠道中，大肠杆菌一般对人无害，但也有一些菌株可以侵袭肠黏膜并产生毒素，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。3．大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。二、

2、实验内容1．本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。2．本实验用LB液体培养基(通用的细菌培养基)扩大培养大肠杆菌。培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。三、细菌的培养和分离1．细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。人们在培养细菌时，一般用接种环转移带菌的培养物。接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，再操作。2．细菌的分离(1)划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养8h，每毫升培养基中就有几亿个细

3、菌。可用接种环蘸菌液在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此，划线到最后，可使细菌间的距离加大。在固体培养基培养10～20h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。接种环在取菌种前和划线前都要灼烧、而后都要冷却、操作完毕后又要灼烧的原因是什么？【提示】　取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划

4、线前都要求接种环冷却后进行，目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释10－5～10－7倍，然后取0.1mL不同稀释度的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。细菌的两种分离法各有优点，都可采用。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。四、灭菌操作1．各种器皿必须是无菌的：实验用具用牛皮纸或报纸包好，所

5、有容器都先封口，然后进行高压蒸汽灭菌(1kg/cm2压力、121℃、15min)处理，并在超净台上使用。注意：实验中所需棉花不能用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水。2．各种培养基必须是无菌的。3．细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。注意：培养皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。五、大肠杆菌培养与分离的实验步骤1．在两个250mL三角瓶中分别装入50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基，加上封口膜。将培养皿包好，连同培养基一同灭菌15min。2．灭菌后待培养基冷却至60℃时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。在酒精灯

6、火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶，左手拿培养皿，并将培养基倒入4个培养皿中，将培养皿置于水平位置上，待其凝固。为什么要在酒精灯火焰旁进行操作？【提示】　酒精灯火焰旁约10cm的空间是一个无菌区，在酒精灯火焰旁操作能防止杂菌污染。3．扩大培养先将接种环在酒精灯火焰上烧红，再深入到大肠杆菌斜面，使环冷却后，取菌体，并将菌体放入三角瓶液体培养基中，封瓶后在37℃每分钟200转的摇床上振荡培养12h。4．划线分离用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到摇床上培养后的菌液中，然后在固体培养基的平板上连续划线，接种环需蘸菌液1次，划线后盖好皿盖，将培养皿倒置，在37℃，恒温培养箱

7、中培养12～24h后，可在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。5.在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱中保存。微生物培养的基本条件1.培养基及其类型(1)培养基：①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，此即培养基。②作用：在提供主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及O2的需求，如培养乳酸杆菌时需在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将pH调至酸性，培养厌氧型微生物需给予无氧条件等。(2)培养基的种类划分标准培养基种类特点用途