脂肪干细胞运用

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1、ADSCs的分离与纯化关于ADSCs的获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂肪干细胞，是一组具有干细胞特性的细胞群。目前应用最广泛的分离方法是酶胶原消化法。首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小的颗粒，PBS液冲洗干净后，用0．1％的胶原酶在37℃下振荡消化4O～90min，再用含10％胎牛血清的等体积DMEM培养基终止。1200r／min离心5～10min，弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过细胞筛过滤，所得细胞按2—4×105／cm接种于50ml培养瓶内。37℃条件5％的CO饱和湿度培养箱内培养，2

2、d后首次换液，以后3d换液一次，至细胞达70％～8O％融合时用0．25％胰酶消化，并传代。经过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁生长，24h内完成贴壁。细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小，核浆比较大，随后细胞体积渐增大，克隆形成。经传代后，细胞的形态及排列才趋于一致。由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性的分子标记物，因此无法利用分子表型来分离纯化。然而可通过纯化脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的。流式细胞仪检测显示：传至第3代时，可达95％以上的细胞纯度。ADSCs的生物学特性1.AD

3、SCs的鉴定在ADSCs鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。用免疫荧光法和流式细胞术检测结果均显示ADSCs表达特异性分子CD44，OCT一4，E—eadherin，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体核型分析显示ADSCs具有遗传稳定性。ADSCs分泌多种生长因子在生理功能方面，脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、转化生长因子一B(TGF—B)、成纤维细胞生长因子

4、(FGF一2)等，低表达的因子有Ang一2C。2.ADSCs的多向分化能力与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞具有储量丰富、取材容易、扩增迅速、不宜衰老、排斥反应低等优点。在特定培养基和特异的诱导剂作用下可分化为特定的体细胞，在组织修复、细胞移植、基因治疗等领域有着潜在价值。向脂肪细胞分化：在特定培养基中加入一定浓度地塞米松、胰岛素、吲哚美辛及1一甲基一3～异丁基一黄嘌呤，3周后发现ADSCs向脂肪细胞分化，可检测出ADSCs表达许多脂肪细胞的特异性标记：脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白aP2、PPAR—r2、leptin(

5、瘦素)、Glut4(葡萄糖转运蛋白等。镜下观察可见胞内有空泡形成。这些特点是脂肪细胞形成的标志。向血管内皮细胞分化：将ADSCs置于含甲基纤维素和血管内皮生长因子的半固体培养基中加以培养，镜下可见有分支状的管腔结构形成，免疫组化证实有内皮细胞特异性的表面标记一CD31和vW因子。Planat等描述了将培养3d的ADSCs注入后肢缺血损伤的实验小鼠后肢肌肉中，15d以后给以血管造影及多普勒检查发现损伤后肢血供出现显著改善的实验结果。向成骨细胞分化:h—ADSCs在加入维生素C、B一磷酸甘油(BGP)和维生素D3的培养基中

6、培养几代后，细胞表面形成的突起，其形态与体内的成骨细胞相似，用茜素红染色可见细胞内出现了钙小结”。国外有将ADSCs作为种子细胞植入网状支架中，成功地修复狗的颅骨的报导。国内马舟涌等将获得的脂肪干细胞和进行成骨诱导后的脂肪干细胞分别种植在复合骨形态发生蛋白和纤维蛋白胶支架上，并移植到骨缺损模型中。实验证明，经诱导后的脂肪干细胞在复合骨形态发生蛋白和纤维蛋白胶支架中可以促进骨骼愈合。这也间接证明了ADSCs的确向成骨细胞分化。向软骨细胞分化：在体外，将维生素C、转化生长因子(TFG)、胰岛素添加到特定培养基里，可以定向诱

7、导AD—SCs向软骨细胞分化。结果在培养基里形成了细胞小结，经免疫组化分析得知，这些细胞小结表达Ⅱ型胶原纤维、硫酸软骨素、硫酸角质素等。杨亚军等用CDMPI体外诱导sD大鼠脂肪干细胞，结果诱导后的脂肪干细胞形态由长梭型向软骨细胞的多角形方向转变。免疫组化显示CDMPI诱导大鼠ADSCs后可以分泌软骨特异性基质糖胺聚糖(GAG)和Ⅱ型胶原，并进一步向软骨细胞方向分化增殖。向心肌细胞分化：从脂肪组织中分离的脂肪基质血管组分(stromalvascularfraction，SVF)即脂肪组织去除成熟脂肪细胞后，所获得的具有于

8、细胞特性的基质细胞，直接种植在半固体的甲基纤维素培养基中，6d后，出现了各种不同的细胞形态，有成群的前脂肪细胞／脂肪细胞，成纤维样细胞等等，11—14d后，一些圆形的细胞开始了独立的收缩活动，在几天内，肌管样结构出现，并大量生长增殖，20—30d后，局部出现了一簇有结合力的细胞群体，和有分支的纤维细胞共同结合在一起。在这期间，24