细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)活性免疫捕获定量检测试剂盒.doc

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1、细胞基质金属蛋白酶2（MMP-2）活性免疫捕获定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞基质金属蛋白酶2（MMP-2）活性免疫捕获定量检测试剂是一种旨在通过使用MMP-2特异性抗体捕获样品中的MMP-2抗原蛋白，识别并切离人工合成含硫多肽，释放出巯基，进而使用Ellman试剂，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）样品中基质金属蛋白酶2的特异活性定量检测。产品严格无菌，即到

2、即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。技术背景基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellularmatrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissueresorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根

3、据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体

4、内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。基质金属蛋白酶-2，又称明胶酶A（gelatinase-A）或IV型胶原酶（typeIVcollagenase），其前体分子量为XX，激活后分子量为XX和XX。它在血清或细胞上清中浓度通常为10至200纳克/毫升。它的作用目标是天然和变性胶原蛋白（collagens）、纤

5、维连接蛋白（fibronectin）、弹性纤维蛋白（elastin）、层粘连蛋白-5（laminin-5）、前体肿瘤坏死因子-α（pro-TNF-α）和神经（蛋白）聚糖（neurocan）。基质金属蛋白酶-2与肿瘤发展与转移、血管形成、动脉粥样硬化等疾病有关。基质金属蛋白酶2的活性检测通过使用MMP-2特异性抗体涂板在孔板里的相应孔里，然后捕获样品中的MMP-2抗原蛋白，在胶原酶潜酶活化剂醋酸氨基苯汞（4-aminophenylmercuricacetate；APMA）的存在下，识别并切离人工合成含硫多肽（th

6、iopeptide）底物Ac-PLG（2-mercapto-4-methyl-pentanoyl）-LG-OC2H5，释放出巯基（sulfhydrylgroup），进而与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoicacid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoicacid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量测定组织基质金属蛋白酶2的特异活性。其反应系统为：产品内容

7、清理液（ReagentA）XX毫升裂解液（ReagentB）XX毫升抗体液（ReagentC）XX毫升缓冲液（ReagentD）XX毫升封阻液（ReagentE）XX毫升激活液（ReagentF）XX毫升反应液（ReagentG）XX毫升标准液（ReagentH）XX微升稀释液（ReagentI）XX毫升产品说明书1份保存方式保存标准液（ReagentH）在-70冰箱里；保存抗体液（ReagentC）激活液（ReagentF）和反应液（ReagentG）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证3月用户

8、自备1.5毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞（微型）台式离心机：用于样品操作培养箱：用于反应孵育酶标板：用于反应分析的容器酶标仪：用于比色分析实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、样品准备1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5X106细