无菌方法验证.doc

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1、无菌方法验证品名：规格：批号：检查时间：1.培养基：硫乙醇酸盐流体培养基，批号：由：提供；营养肉汤，批号：由：提供；改良马丁培养基批号：由：提供。2.验证试验用菌种：(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]；(2)枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]；(3)大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]；(4)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104](5)生孢梭菌

2、(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]；(6)白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]；(7)黑曲霉菌(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]。3.仪器和滤器：zw-2008智能集菌仪zw-808a智能集菌仪4.方法：中国药典2005版二部附录。5.操作方法：5.1菌液制备：取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中,生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中,℃培养小时。

3、取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、生孢梭菌肉汤培养物，加生理盐水，10倍递增稀释至约10-5~10-8之间，其中金黄色葡萄球菌取稀释级，铜绿假单孢菌取稀释级，大肠埃希菌取稀释级，枯草芽孢杆菌取稀释级，生孢梭菌取稀释级。白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中,℃培养小时。再取白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取加生理盐水，10倍递增稀释至，取加生理盐水，混匀备用。将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁培养基上，℃培养，使大量的孢子成熟。再取黑曲霉真菌斜面培

4、养物，加入生理盐水洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，稀释至，取加生理盐水混匀备用。5.2菌液计数：分别取上述5种细菌菌液加入硫乙醇酸盐流体培养基中，每种菌液做平行管。℃培养。分别取上述2种真菌菌液加入改良马丁培养基中，每种菌液做平行管。℃培养。细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。表1    细菌数计数结果菌种大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌生孢梭菌计数(CFU)均值(CFU)表2   真菌数计数结果菌种黑曲霉菌白色念珠菌计数(CFU)均值(CFU)5.3培养基灵敏度检查：取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流

5、体培养基11支，分别接种的大肠埃希菌菌液ml，金黄色葡萄球菌菌液ml、枯草芽孢杆菌菌液ml、铜绿假单胞菌菌液ml、生孢梭菌液ml各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天。取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种白色念珠菌菌液ml，黑曲霉菌ml各2支，另1支不接种作空白对照，培养5天。结果如下表：表3硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查观察结果菌种大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌生孢梭菌CFU阴性对照表4改良马丁培养基灵敏度检查观察结果菌种黑曲霉菌白色念珠菌CFU阴性对照6.供试液制备：取样品袋，分别用力挤

6、压使两室完全贯通，药物充分溶解备用。7.薄膜过滤：将供试品液按薄膜过滤法过滤，氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次，冲洗液量分别考察：ml，ml,在最后一次的冲洗液中逐一加入试验菌少于100CFU。按规定将培养基直接加至滤筒内。每天观察并记录结果。7.1阳性对照：取以配制好的大肠埃希菌菌液ml，金黄色葡萄球菌菌液ml、枯草芽孢杆菌菌液ml、铜绿假单胞菌菌液ml、生孢梭菌细菌菌液ml，分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基中；取白色念珠菌菌液ml，黑曲霉菌ml，分别接种至改良马丁培养基。7.2阴性对照：两个滤器桶内各过滤氯化钠-蛋白胨缓冲液

7、ml，然后取出滤膜分别加入硫乙醇酸盐培养基和改良马丁培养基中，不加对照菌液，分别给以相应条件培养。8.培养：硫乙醇酸盐流体培养基培养；改良马丁培养基培养。9.结果9.1实验结果见表5和表6。 大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌生孢梭菌冲洗量ml冲洗量ml 阳性对照阴性对照表5  细菌实验结果(20小时观察)表6    36小时观察真菌结果 黑曲霉菌白色念珠菌冲洗量ml冲洗量ml阳性对照阴性对照10.结论：检验人：复核人：检验人：结论阴性对照阳性对照改良马丁培养基硫乙醇酸盐流体培养基培养时间（天）供试液的配制：。

8、检查法：1、直接接种法2、薄膜过滤法品名复核人：无菌检查记录123456规格78910批号1112检测日期1314备注