过量表达lehsp215减缓番茄的upr应答并增强其耐逆性

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1、山东师范大学博士学位论文过量表达LeHSP21．5减缓番茄的IJI墩应答并增强其耐逆性(山东师范大学生命科学学院，济南，250014)摘要真核细胞内质网中未折叠蛋白的积累会引起内质网胁迫(ERstress)，激活未折叠蛋自应答(UPR)信号途径，从而诱导内质网中分子伴侣的表达(比如BiP和Calnexin等)。目前关于内质网中分子伴侣在UPR匣答机制中作用的研究主要集中于高分子量热激蛋白，而对小分子热激蛋白相关的研究较少。我们通过对番茄LeHSP21．5蛋白的表达特性和亚细胞定位分析，发现其为典型的内质网定位的小分子热激蛋白。为研究内质网小分子热激蛋白在UPR信号系统中

2、的功能，我们构建了三吐毽P2j．J基因的真核表达载体并转化番茄，获得了过量表达内质网小分子热激蛋白的转基因株系，并分析了在各种逆境胁迫下，转LeHSP21．5基因番茄中的UP赃答反应。主要结果如下：l、Northern和Westem杂交均表明LeHSP2J．5基因是一个热诱导型基因，但其启动子并非高效，且其表达不受低温和高盐的诱导；Southern杂交结果表明，该基因在番茄基因组中是单拷贝；LeHSP21。5蛋白在膜微囊泡各片层中的分布趋势同内质网标志蛋白Calnexin的分布一致，初步说明LeHSP21．5蛋白定位于内质网中。2、将LeHSP21．J的全长eDNA序列

3、构建到组成型启动子(CaMV35S)控制的pROK2真核表达载体中，转化农杆菌LBA4404，通过农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄，获得了过量表达￡“蕊舶J．j基因的转基因番茄，通过Southern杂交证实外源基因已整合入番茄基因组，Northern杂交证实，外源LeHSP21．j基因在常温条件下的番茄转基因株系中呈现组成型表达，但不同的转基因株系LeHSP21．5表达信号强度有所差别。非胁迫条件下转基因番茄的生长发育与对照之间没有可见差异，说明外源基因的转入未影响植物的正常生长。‘3、比较转LeHSP21．5基因番茄和未转基因番茄在ERstress诱导剂(衣霉素和DTT)

4、处理下的生活力和存活率，发现过量表达LeHSP21．5蛋白提高了转基因番茄整株植物对衣霉素等的抗性．Northern分析结果表明，衣霉素处理使未转基因番茄中BiP、尬瘌ealnexinmRNA和蛋白的诱导表达量迅速升高，转基因番茄中这些分子伴侣的表达量也有所增加，但表达强度明显低于未转基因番茄。基于以上实验数据，本文首次证明LeHSP21．5能够减轻ERstress．山东师范大学博士学位论文4、未转基因番茄能够通过U]PR应答，诱导分子伴侣的短期表达，暂时减轻低温胁迫导致的ERstress，但不能避免长期的ERsIie8$所造成的细胞死亡。而过量表达的LeHSP21．5

5、明显减缓了低温胁迫下转基因番茄中内质网分子伴侣BiP、脚CalnexinmRNA的诱导表达，并维持持久的表达量，提高了长期ERstress条件下细胞的存活能力。比较温度胁追对转LeHSP21．j基因番茄和未转基因番茄的影响，发现LeHSP21．5的过量表达并不导致植物耐热能力的提高，但提高了转LeHSP21．5基因番茄耐低温胁迫的能力。转基因番茄具有更好的抵御低温胁迫所引起的次级胁迫．氧化胁迫的能力，保证细胞内膜结构的完整，降低光合机构的受损程度，从而维持较离的光合效率。转基因番茄在低温下也能够维持较好的渗透调节能力，合成更多的渗透调节物质，来抵御调节低温胁迫所造成的次

6、级水分胁迫。转基因番茄在低温胁迫下的存活率以及果实在低温下的耐冷藏品质均显著提高。5、过量表达的LeHSP21．5也减缓了盐胁迫条件下转基因番茄中内质网分子伴侣BiPmRNA和Calnexin蛋白的诱导表达，并维持持久的表达量，提高了长期ER8tress条件下细胞的存活能力。比较盐胁迫对转LeHSP21．5基因番茄和未转基因番茄的影响，发现LeHSP21．5的过量表达提高了转LeHSP21．，基因番茄耐盐胁迫的能力。转LeHSP21．5基因番茄比对照植株含有更多的K?、CaX+，这些离子的含量与转基因植株的耐盐能力成正相关。转基因株系的相对含水量也高于对照，表明它们具有

7、较高的渗透调节水平和持水能力。转基因番茄具有更好的抵御氧化胁迫的能力，光合机构受损的程度低，从而维持较高的光台效率。本论文主要创新点：l、证明LeHSP21．5蛋白在内质网中的亚细胞定位。2、获得了过量表达LeHSP21．5蛋白的转基因番茄，证明LeHSP21．5蛋白的过量表达能够减轻衣霉素等引起的ERstress，减缓UPR应答。3、证明低温诱导的植物UPR应答，并证明LeHSP21，5蛋白的过量表达能够减缓低温胁迫引起的UPR，提高转基因植物的耐低温胁迫能力。4、证明LeHSP21．5蛋白的过量表达能够减缓盐胁迫引起的UPR，提高转基