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1、结缕草体细胞胚与植株再生试验方案一、直接体细胞胚发生途径1.试验材料：选取结缕草的茎基为外植体。所用的试剂和容器为：2,4一D，6—BA,TDZ，NAA，塑料三角培养瓶2.试验方法（1）低温预处理：将结缕草组培苗培养于三角瓶内的固体培养基上MS+6—BA（3.0mg/L）+NAA（0.2mg/L）,蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8.每瓶内放置三个株丛。然后放进微电脑人工气候箱内，温度为5°C,暗培7天后取出。（2）体细胞胚的直接诱导：以2,4-D,6-BA和TDZ作为参选因素（分别标
2、记为A,B,C），每个因素取3个水平：A（1.5、2.0、4.0mg/L）、B（0、0.1、0.5mg/L）和C（0、0.1、0.5mg/L）。选用正交设计表L9（33）安排结缕草茎基直接诱导体细胞胚的试验方案。从而探索三种植物生长调节剂对结缕草茎基直接诱导体细胞胚发牛的影响。表1结缕草体细胞胚诱导的正交试验方案水平A2,4-D因素巳6-BACTDZ11.50022.00.10.134.00.50.5无菌条件下，切取直立枝幼嫩茎的基部区域，剥离其外而的维管束层后接种在含不同质量浓度的2,4-D、
3、6-BA和TDZ的MS培养基上，每瓶放置5个，每种培养基接5瓶，共45瓶；培养条件为：（25±1）°C遮光。（3）体细胞胚直接发生和形态学观察：在含有植物生长调节剂的培养基中,可逐渐观察到茎基表而出现体细胞胚。将获得的不同时期的体细胞胚在Olympus体视显微镜卜*观察拍照，观察体细胞胚直接发生的过程及形态结构特占„（4）体细胞胚发育成为完整植株：培养30d后，将直接发生的体细胞胚与茎基分丌后，转接至不含任何植物生长调节剂的MS培养基屮，然后将其转移至光下，在光照强度为3000IX,光照时间为8
4、h/16h（光/暗）条件下促使体细胞胚萌发、仲长、生根，最后吋发育成为完整植株。（5）统计与分析：培养30d后，统计直接发生体细胞胚的茎基率；每种处理选取三瓶，统计每瓶的直接发生体细胞胚数和外植体数。直接发生体细胞胚的茎基率％=直接发生体细胞胚的茎基数/外植体数X100%平均体细胞胚数/茎基（即单茎基平均体细胞胚数）=每瓶总体细胞胚数/每瓶总外楨体数X100%二、间接体细胞发生途径1.试验材料：同上2.试验方法（1）低温预处理：同上（2）愈伤组织的诱导：以2,4-D,6-BA和TDZ作为参选因素
5、（分别标记为A,巳，C），每个因素取3个水T:A（1.5、2.0、4.0mg/L）、B（0、0.1、0.5mg/L）和C（0、0.1、0.5mg/L）。选用正交设计表L9（34）安排结缕草胚性愈伤组织诱导的试验方案（表1）。无菌条件下，切取直立枝幼嫩茎的基部区域，剥离其外面的维管朿层后接种在含不同质量浓度的2,4-D、6-BA和TDZ的MS培养基上，每瓶放置5个，每种培养基接5瓶，共45瓶；培养条件为：（25±1）°C遮光。30d后将长出的愈伤组织切成1cm3大小的小块进行继代培养30d，继代培
6、养基与原培养基同。(3)胚性愈伤组织的鉴定：以茎基为外植体诱导培养60d后，将获得的不同形态的愈伤组织在Olympus体视显微镜卜*观察拍照，然肜用FAA固定液固定，石蜡切片法切片，纵切切片厚度8-10um,番红固绿染色，加拿大树胶封片，在Olympus光学显微镜下观察并照相。通过对比不同形态愈伤组织的外部形态和内部细胞结构，从而获得通过外观判断愈伤组织有无胚性的依据。(4)体细胞胚诱导和植株再生：将诱导培养60d后获得的胚性愈伤组织转接至体细胞胚诱导培养基，即不含任何植物生长调节剂的MS培养基
7、中，(25士1)°C遮光条件下，诱导培养30d后产生体细胞胚。然后转移至光下促使体细胞胚萌发、伸长、生根，发育成为完整植株。光照强度为3000IX,光照吋间为8h/16ho(5)统计与分析:将I卜:交设计试验中诱导获得的愈伤组织转移至MS培养基中诱导体细胞胚，培养30d后，统计胚性愈伤组织块数，即能够诱导形成体细胞胚的愈伤组织块数；每种处理选取三瓶，统计每瓶的胚性愈伤组织上发生体细胞胚数和胚性愈伤组织数。胚性愈伤组织诱异率％=胚性愈伤组织块数/外植体数X100%平均体细胞胚数/胚性愈伤组织数(即
8、平均每胚性愈伤组织体细胞胚数)％=每瓶总体细胞胚数/每瓶总胚性愈伤组织数X100%三、结缕草体细胞胚发生的组织形态学观察1.试验材料：以结缕草的茎基诱导形成的胚性愈伤组织和体细胞胚为试验材料2.试验方法：将胚性愈伤组织和不同阶段的体细胞胚用FAA固定液固定，石蜡切片法切片，纵切，切片厚度8-10um,番红固绿染色，加拿大树胶封片，在Olympus光学显微镜下观察并照相。3.结果与分析(1)体细胞胚发生过程中的细胞形态学观察(2)体细胞胚发育过程屮不同吋期的形态特征结缕草体细胞胚直接发生与间接发生
