基因工程复习整理资料

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1、第一章重组DNA技术：将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。基因工程：重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。遗传工程：采用基因工程方法和技术人工改造生物遗传性，细胞融合，花粉培育，常规育种、有性杂交。生物工程

2、：包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程（生化工程）、蛋白质工程基因工程的三大理论基础：1.生物的遗传物质是DNA2.明确了DNA的双螺旋结构、屮心法则3遗传密码子的破译基因工程的三大技术发明：限制性内切酶和连接酶：DNA的“手术刀”与“缝纫机”载体：运送遗传物质的工具，如质粒、病毒等逆转录酶：从mRNA到DNA,使真核基因制备成为可能基因工程研宄内容：目的基因的获得目的基因与载体的连接成重组DNA分子重组DNA分子导入受体细胞筛选重组克隆基因表达与产物分离第二章基因工程基本操作技术：核酸的凝胶电

3、泳，PCR技术，分子杂交，基因突变技术。1、PCR（polymerasechainreaction）技术①变性变性不完全：导致PCR失败，未完全变性的双链DNA会很快S性，减少DNA产量；变性吋间过长或温度过高：导致聚合酶活性下降，扩增效率降低Taq酶活性的半衰期为:92.5度130min;95度40min;97度5min②退火引物退火的温度和所需时间取决于引物的碱基组成、引物的长度，引物与模板的匹配程度及引物的浓度。退火温度越高，所得产物的特异性也越高实际使川的退火温度双扩增引物的Tm值低5-10

4、度退火温度的选择两条引物间的Tm值相差小于5°C,最好1°C。退火温度以两条引物中Tm值较低的为准，并且低5-10°CTm=（A+T）X2+（C+G）X4+3.3°CATCG指引物与模板直接配对的部分，外加碱基不算。③延伸延伸反应通常在72度进行，接近Taq酶的最适温度75度。在一般反应体系中，Taq酶每分钟可以合成约2kb长的DNA片段。在能完成DNA合成的前提下应尽量缩短延伸吋间，减少Taq酶活性的损失。(1)引物(P31)DNA聚合酶需要一小段双链DNA来启动新链的合成。所谓PCR扩增引物，是

5、指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段，其长度在15-30个核苷酸之间。上游引物，是与基因的5’端互补的寡核苷酸，用于扩增编码链；下游引物，是与基因的3’端相同的寡核苷酸，用于扩增DNA模板链。两引物在模板DNA上结合之间的距离决定了扩增区段的氐度。实验表明，lkb之内是理想的扩增长度；2kb是有效的扩增长度；3kb以上则难上有效的扩增。引物2、引物13f―=5'设计引物的基本原则①引物长度：15-30b,指模版与引物相配对的碱基数：应随机排列，避免同一碱基串联。e.g.引物长

6、度为8个核苷酸：48=65536bp43000个可能17个核苷酸：417=17179869184bp超过5倍人类基因组DNA长度：3X109bp②可以在5’端加适量的保护碱基或酶切位点序列原因：5’端的无关序列不会影响引物特异序列的退火引物的3’末端和模板的碱基要完全配对③防止引物对间及引物闪的同源性，尤其是3’端不能出现碱基同源，3’最好不出现碱基A④GC的合理含量(P32)与Tm值的范围0的DNA:5’一ATGGGAAGCTGCTGTTACCTCCGCACTTCGGACCTCCTAAGACACT

7、CTCTACAG-3’上游序列：5’一ATGGGAAGCTGCTGTTACCTC—3’G+C含量=?%下游序列：5’一CTGTAGAGAGTGTCTTAGGAG-35G+C含量=?%⑤引物的设计软件：Oligo6,PremierPrimer,DNAstar，FastPCRetc.其他概念：简并引物，嵌套引物2、反转录PCR(RT-PCR)反转录PCR:先将mRNA反转录成cDNA,然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。mRNA—cDNA——PCR抽提RNA、反转录合成cDNA、PCR扩增mR

8、NA□AAAAAAA-3，反转录酶暴3-Ci.xTl.Xi.XXXlkXX.XXJ—.AAAAAAA，cDNAcDNAaPCR■TTTTTTT-5RT-PCR3、实时荧光定量PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲巢式PCR(nestedPCR)是一种PCR改良模式，它使用巢式PCR引物来增强反应的敏感性和特异性，巢式PCR方法由两轮PCR扩增和利川两套引物对所组成，在笫一轮扩增巾，使用一对外引物产生扩增产物，然后用