灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠外周血cd4cd8影响的实验研究

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1、灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠外周血CD4CD8影响的实验研究【摘要】目的：观察灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+的影响。方法：以醋酸泼尼松注射液(AHP)对大鼠进行肌肉注射以建立阳虚大鼠模型，比较运用灵龟八法开穴灸与穴位(足三里、肾俞)温和灸对模型大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+变化的影响。结果：灵龟八法开穴灸组和足三里、肾俞温和灸组模型大鼠与正常组大鼠外周血CD4+/CD8+比值变化无明显差异。结论：灵龟八法开穴灸法可以提高阳虚模型大鼠外周血T淋巴细胞免疫功能。【关键词】阳虚模型

2、，灵龟八法，足三里，肾俞，T淋巴细胞亚群。中医学认为，阳虚是指机体阳气偏衰、正气不足，从而表现出一系列机能衰退，代谢减弱的病理状态［1］。研究显示免疫系统功能低下属于阳虚的范畴。CD4+、CD8+是T淋巴细胞的亚群，其比值是反映免疫系统功能状况的重要指标之一。大量临床实践表明灸法对治疗阳虚证有很好的疗效，而灵龟八法这种按时开穴的方法是中医学整体观念的重要体现，能提高针灸临床疗效。本实验主要从灵龟八法开穴灸法的角度来探讨灸法防治阳虚证的免疫学机理。1材料与方法1.1实验动物选用SD大鼠50只，230g~280g（SPF级，武

3、汉大学动物实验中心提供，许可证号:SCXK（鄂）2008-0004），雌雄兼用。1・2主要药品与试剂醋酸泼尼松龙注射液（AHP）：125mg/5nil浙江仙堀制药股份有限公司（国药准字H33020824,生产批号120912）；艾灸条：南阳市绿佳艾绒厂；FITC（一硫氧酸荧光素）标记小鼠抗大鼠CD4单克隆抗体、PE（藻红蛋白）标记小鼠抗大鼠CD8单克隆抗体、APC（别藻蓝蛋白）标记小鼠抗大鼠CD3单克隆抗体：美国eBiscience公司产品；红细胞裂解液，武汉谷歌牛•物科技有限公司产品，货号:G-2015；胰酶Trypsi

4、n,Amresco公司产品，货号：0457；0.9%氯化钠注射液；1%肝素钠注射液；自配PPS液等。1・3主要仪器设备FACsort流式细胞仪（美国BD公司）、飞鸽TD2S0-2H离心机（上海安亭公司）、SW-CJ-1FD洁净工作台（苏净安泰公司）等。1・4实验方法1.4.1阳虚大鼠模型的建立选用SD大鼠，每只老鼠每天按照3mg/100g体重标准进行大腿外侧肌肉注射AHP,连续5天。大鼠岀现背部拱起、身体蜷曲、四肢尾冷、蜷缩在一起、神情疲惫、反应呆滞、被毛疏松、暗淡无光、身体消瘦、食欲减退、不耐低温、精神萎靡、毛发脱落等虚

5、损症状[1]o根据中医八钢辩证之阳虚证，辨证参考标准[2],类似“阳虚”状态，说明此次试验所建立的阳虚大鼠动物模型属成功模型。1.4.2实验动物分组将建立好的阳虚模型大鼠按随机数字表随机分组，建立好的阳虚模型大鼠不予干预视为阳性空白对照组（A组），足三里、肾俞温和灸组（B组）,灵龟八法开穴灸组（C组）,灵龟八法开穴灸结合足三里、肾俞温和灸组（D组），正常大鼠视为阴性空白对照组（E组），共5组，每组10只，雌雄分养。1.4.3治疗方法B、C、D组大鼠每天每穴温和灸15分钟，左右交替进行，连续2周。灵龟八法开穴法依据《了午流注

6、与灵龟八法临床应用盘》（魏晋盛主编，山西科学技术出版社，2010年10月，第一版）简易法选穴。A、E组大鼠只抓取，不做治疗。穴位定位：“足（后）三里”穴（双），定位于后肢胫骨粗隆外膝至踝间上1/5处［3］；“肾俞”穴，定位，首先用手触摸到大鼠背部脊柱及两旁的肋骨，在肋骨结束的水平，定位第十二胸椎，然后往下数二个棘突，左右旁开lOmm（同身寸，大约为人体的1/10）即为“肾俞”穴［小。灵龟八法开穴所需其它穴位定位参考李辞蓉等编著的《大鼠针灸穴位图谱的研制》。1.5观察指标及检测方法1.5.1血液标本采用心脏采血法收集实验大鼠

7、血液2ml快速放置在EDTA抗凝管中，以避免采集的标本发生溶血和凝血现象。将收集的血液放入离心机，进行3000转每分钟离心10分钟，并取上清液置于l・5mlEP管中，标记后放入-20°C冰箱中保存。在离心后的血液沉淀加入3mllX红细胞裂解液，摇匀后静置15分钟。放入离心机进行1500转每分钟离心5分钟，弃去上清液。次操作需重复两次。1.5.2细胞标本(1)收集培养液于流式管中，此时的培养液中有少量悬浮细胞。(2)六孔板中的细胞用PBS洗涤一次，加入lnil0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入PBS缓

8、冲液终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。收集于流式管中，进行每分钟1500转离心5分钟，之后弃上清。(3)加入3ml4°C预冷的PBS缓冲液中重新悬浮细胞，1500转/分钟离心5分钟，弃上清。(1)沉淀加入100u14°C预冷的PBS重悬细胞。(2)加入荧光标记的一抗2ul,混匀后于37°C培养