金钗石斛的脱毒快繁技术

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1、植物组织培养课程设计专业：生物科学与生物技术班级：B11学号：B11姓名：张。。。金钗石斛的脱毒、快繁技术植物组织培养脱毒快繁是人工在无菌条件下利用植物体的一部分，在人工控制的营养和环境条件下繁殖植物.脱除病毒得到无毒苗株，继而在人田快速殖的技术。脱毒及离体快繁，这是口前杭物组织培养应用最多、最广泛和是有效的一个方而.主要是进行茎尖培养脱除病毒。对于脱毒苗、新育成、新引进、稀缺良种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快速繁殖，同时可不受地区和气候的影响。比传统的繁殖方法快数万倍。植物组织培养己发展成为一门富有生命力的学科。脱毒与

2、快繁经过50年世界范围内大规模研究，植物离体快繁的技术体系已相对成熟，其操作程序一般划分为5个阶段：1.无菌培养的建立（包括外植体的选择、培养基、外植体的消毒和接种）2.初代培养；3.继代培养和快速增值；4.诱导生根；5•驯化移栽。无菌培养基的建立1外植体的选择文献报道的外植体有种子、无菌苗幼苗茎段、原球茎及人工种子，其他的外植体的研究还未见报道•据研究，由种子诱导的愈伤组织的分化能力较强，而且由种胚培养的原球茎的质量较高。在进行金钗石斛组织培养时,初代培养最敏感的因子是材料的部位，其次是激素比例，基本培养基影响较小。2外植体处理2.1预

3、处理在取材前1・2周，把母株置于温室内培养，不要给它喷水，在接种前选择健壮无病的当年牛长的幼株剪下，置于1000mL烧杯中，然后放在水龙头下，用流动的自来水冲洗10min,尔后将金钗石斛幼株用无菌水漂洗2次。2.2外植体表面灭菌操作方法将预处理过的幼株放置于烧杯中，倾入75%的酒精使之没过外植体，并轻晃以除去所附气泡，经过10—15s后，倾去酒精，用无菌水冲洗外植体.接着再用0.1%的氯化汞水溶液浸泡幼株8-10min,灭菌结朿后，倾出消毒液，再注入适量的无菌水，用无菌蹑子搅动数次，再将水倒掉，如此重复3-4次•然后把消毒过的外植体吸干水

4、后包在无菌的滤纸屮或放在干燥灭过菌的培养皿里备用。在接种前先将所使用的器械（解剖刀、银子、剪刀等）用75%的乙醇进行表面消毒，再将它们放在酒精灯的火焰上灼烧，然后放在支架上冷却备用。3培养基的配制（MS母液）母液种类成分规定量mg/L扩大倍数称取暈/g/L母液体积ml吸取量ml母液1KNO319005095.0100020NH4NO3165050825MgSO4・7H20370501&5母液2CaC12・2H2044010022.050010母液3KH2PO41701008.550010母液4Na2-EDTA3731001.8655001

5、0FeSO4■7H2027.81001.390母液5H3BO36.21000.3150010MnSO4•4H2022.31001.115ZnSO4・7H208.61000.43KI0.831000.0415NaMoO4•2H2O0.251000.0125CuSO4-5H200.0251000.00125CoC12・6H200.0251000.00125母液6肌醇1002005.02505甘氨酸2.02000.1烟酸0.52000.025VB60.52000.025VB50.12000.0054激素在石斛繁殖培养基屮一般采用的激素有IBA,

6、NAA,6-BA,2,4・D,AD等,其中研究最多的是NAA和6-BAo芽诱导培养基中激素一般为6・BA,NAA.增殖培养基为6-BA.NAA;生根培养基多选用IBA.KT或NAA.在MS培养基上，6-BA质量浓度为2.0-3.5mg/L时，随着质量浓度的增高，侧芽增殖倍数随之增大.但当6-BA为3.5-4mg/L口寸，增殖芽虽多却弱;NAA为0.2-0.5mg/L.有利于壮芽的成长，当为0.8mg/L,壮芽趋势不明显•当6-BA为3.0mg时，不管NAA浓度是多少，侧芽增殖芽数相差不大，只是随着一定浓度的增高芽愈壮。5脱毒选取健壮无污染

7、的组培苗，在超净工作台上，仔细剥离外围组织，当顶端分牛组织充分暴露出来后，用锋利的解剖刀切下大小0・1-0.2mm的茎尖，使茎尖项部向上接种到不同培养基上。6培养条件培养基pH均为5.3左右，蔗糖、琼脂含量分别为30g/L和7g/L,培养的光照强度为20001X.光照12h/d,，培养温度为25~27摄氏度。7病毒检测抗血清鉴定法要进行抗原的制备（包括病毒的繁殖，病叶研磨和粗汁液澄清等）•抗血清的采收、分离等。血清可分装到小玻璃瓶中，贮存在・15〜・25°C的冰冻条件下。测定吋，把稀释的抗血清与未知的病毒植物在小试管内混合，这一反应导致形

8、成可见的沉淀。然后根据沉淀反应来鉴定病形，即使淘汰血清学阳性反应。二、初代培养将消毒好的的金钗茎尖或幼茎切成1.0cm左右，接种到MS+6-BA2.0+NAA0.5+2.0%蔗糖启动培养基上，